研究者詳細 - 本望　修

共同研究・競争的資金等の研究課題 - 本望　修

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慢性期脳梗塞に対する骨髄幹細胞治療における至適リハビリ条件の探索

基盤研究(C)

研究期間:

2024年04月

2027年03月

山下達郎, 佐々木雄一, 佐々木祐典, 鵜飼亮, 岡真一, 佐々木優子, 本望修, 中崎公仁

神経障害性疼痛・脊髄障害性疼痛に対する間葉系幹細胞の治療メカニズムの解析

基盤研究(C)

研究期間:

2024年04月

2027年03月

福士龍之介, 佐々木祐典, 小原尚, 廣田亮介, 佐々木優子, 山下敏彦, 本望修

脳梗塞に対する骨髄幹細胞治療による神経回路の再構築の革新的MRIによる統合的解析

基盤研究(C)

研究期間:

2024年04月

2027年03月

長濱宏史, 佐々木祐典, 本望修, 中崎公仁

脳梗塞と脊髄損傷に対する中枢神経系全域の可塑性賦活化による治療戦略の検討

基盤研究(B)

研究期間:

2024年04月

2025年03月

本望修, 佐々木雄一, 福士龍之介, 佐々木祐典, 小原尚, 鵜飼亮, 小林萬里, 山下達郎, 横山貴裕, 岡真一, 佐々木優子, 中崎公仁

脳梗塞に対する複数回骨髄幹細胞投与における至適リハビリ条件の探索

基盤研究(C)

研究期間:

2023年04月

2026年03月

佐々木雄一, 鵜飼亮, 山下達郎, 岡真一, 佐々木優子, 本望修

近年、骨髄間葉系幹細胞（MSC）を用いた細胞療法(MSC治療)は、再生医療の分野で脳梗塞や脊髄損傷に対する新しい治療方法として注目されている。我々は、既にラット脳梗塞モデルに対するMSC治療にリハビリテーション（リハビリ）を併用すると、リハビリ単独群やMSC治療単独群よりも、さらに高い運動機能の回復が得られることを報告した。また、これまでの実験的脳梗塞に対するMSCの治療効果を示した研究では、MSCの単回投与がほとんどであったが、さらなる治療効果を得るために複数回投与に期待が集まっている。我々は、ラット慢性期脳梗塞モデルにMSCを複数回投与すると、単回投与群やvehicle群と比較して、脳梗塞体積に違いはないものの運動機能の改善が得られることを報告した。しかし、MSC複数回投与におけるリハビリテーション併用の効果を検討した研究はない。本研究では、MSC複数回投与に併用する適切な運動（リハビリ）の種類や頻度・強度を考慮し、回復経過を分子メカニズムなど様々な視点から詳細に比較解析することで、MSC複数回投与の治療効果を最大限に引き出すための新しいリハビリ方法を確立することを目的としている。特に、運動強度と運動時間をなどの負荷量に注目し、脳の可塑性のパターンの変化、神経回路の再構築、シナプス新生などの観点から解析を進めている。現在までに、本研究費によって、各運動負荷における実験的脳梗塞に対する治療効果の行動学的解析、MRI解析、神経トレーサーを用いた神経解剖学的解析などを行っている。以上のように、補助金は補助条件に従って、有効に使用されている。

骨髄間葉系幹細胞移植による慢性腎臓病および連関する脳血管障害の同時進行抑制

基盤研究(C)

研究期間:

2023年04月

2026年03月

長岡由修, 飯塚裕典, 寺田光次郎, 津川毅, 佐々木祐典, 本望修

新生児低酸素性虚血性脳症に対する次世代型エクソソームを用いた新規治療法の開発

基盤研究(C)

研究期間:

2023年04月

2026年03月

寺田光次郎, 津川毅, 飯塚裕典, 佐々木祐典, 長濱宏史, 坂井拓朗, 本望修

脊髄損傷に対する骨髄幹細胞による治療メカニズムに占めるミトコンドリア機能の解析

基盤研究(C)

研究期間:

2023年04月

2026年03月

佐々木祐典, 鵜飼亮, 岡真一, 佐々木優子, 本望修

脊髄損傷後に神経症状の増悪をもたらす二次損傷の病態解明は重要である。近年、二次損傷に占めるミトコンドリアの役割に注目が集まっており、脊髄損傷後に生じるミトコンドリアの機能不全によるATP合成不全が惹起するエネルギー代謝不全、活性酸素の産生増加、神経毒性の増加などが神経症状の増悪に関与すると報告されている。一方、我々はこれまで、脊髄損傷ラットモデルおよび脊髄損傷患者に対する骨髄幹細胞の経静脈的投与 (MSC治療)による運動機能の改善を報告してきた。この中で、MSC治療後に、ミトコンドリアの代謝機能に関連する遺伝子群が存在することを見出した。本研究では、脊髄損傷に対しMSC治療を実施し、①損傷局所および②大脳皮質の神経系細胞内におけるミトコンドリアの機能の変化を詳細に解析することを計画した。これらの解析を通じて、MSC治療により惹起される神経機能の回復に貢献するメカニズムにミトコンドリアが強く関与していることを明らかにし、次世代の治療法の開発に展開することを最終的な目標として、これまでに雄性SDラット (250-300g)に実験的脊髄損傷 (IH-0400 Impactor)を作製後にMSCの経静脈的投与を行い (MSC群)、運動機能を評価した。さらに、細胞外フラックスアナライザー (Xfe96, Agilent)を用いて、ミトコンドリアエネルギー代謝機能である酸素消費速度 (oxygen consumption rate: OCR)および細胞外酸性化速度(extracellular acidification rate: ECAR)を測定の予備的実験を開始した。

脳梗塞と脊髄損傷に対する中枢神経系全域の可塑性賦活化による治療戦略の検討

基盤研究(B)

研究期間:

2022年04月

2025年03月

本望修, 佐々木祐典, 鵜飼亮, 岡真一, 佐々木優子

健康寿命延長に関与する骨髄幹細胞の自己治癒能と全身の恒常性維持

基盤研究(C)

研究期間:

2022年04月

2025年03月

佐々木優子, 佐々木祐典, 鵜飼亮, 岡真一, 本望修

骨髄間葉系幹細胞を用いた難治性てんかんの新規治療法開発とメカニズム解明

基盤研究(C)

研究期間:

2022年04月

2025年03月

福村忍, 津川毅, 佐々木祐典, 長濱宏史, 本望修

脊損に対する骨髄幹細胞治療で介在ニューロンの関与で再構築された神経回路の解析

基盤研究(C)

研究期間:

2022年04月

2025年03月

小原尚, 福士龍之介, 廣田亮介, 佐々木祐典, 栗原康太, 山下敏彦, 佐々木優子, 本望修

脳梗塞に対する次世代型エクソソームを用いた革新的治療法の開発

基盤研究(C)

研究期間:

2022年04月

2025年03月

鵜飼亮, 佐々木祐典, 本望修

慢性期脳梗塞に対する骨髄幹細胞とリハビリ併用による脳のplasticityの解析

基盤研究(C)

研究期間:

2021年04月

2024年03月

山下達郎, 佐々木祐典, 本望修, 鵜飼亮

近年、骨髄間葉系幹細胞(MSC)を用いた細胞療法(MSC治療)は、再生医療の分野で脳梗塞や脊髄損傷に対する新しい治療方法として注目されている。MSC移植の治療メカニズムは、①サイトカインによる神経栄養作用、②血液脳関門機能の修復、③血管新生、④脱髄軸索の再有髄化、⑤神経再生による脳のplasticityの調節、と多段階・協奏的に作用することが判明しており、臨床上の神経症状の回復も、ほぼこれと平行して進むことが判明している。我々は、既にラット急性期脳梗塞モデルに対してMSC移植にリハビリを併用すると、リハビリ単独群やMSC移植単独群よりも、さらに高い運動機能の回復が得られるこという報告をした。MSCは、1)梗塞巣周囲に集積し、2)脳梗塞体積を減少させ、3)脳梗塞周辺領域のシナプス新生を誘導し、4)脳梁萎縮を抑制、するが、リハビリを併用すると、脳の可塑性のさらなる亢進を誘導することが可能となり、より高い治療効果が得られることを明らかにした。さらに慢性期脳梗塞モデルに対するMSC移植は、運動機能が改善されることを明らかにした。急性期と慢性期で病態は異なるが、MSCが発揮する多彩な治療メカニズムを考えると、慢性期にMSC移植とリハビリを併用することでさらなる治療効果が期待できると考えられる。本研究は、慢性期脳梗塞モデルに対するMSC移植にリハビリを併用することで、機能改善をもたらすメカニズムを脳の可塑性の変化に注目して解析することを目的としている。現在までに、本研究費によって、実験的慢性期脳梗塞に対する治療効果の行動学的解析、MRI解析、神経トレーサーを用いた神経解剖学的解析などを行っている。以上のように、補助金は補助条件に従って、有効に使用されている。

脊髄損傷に対する次世代型エクソソームを用いた革新的治療法の開発

基盤研究(C)

研究期間:

2021年04月

2024年03月

廣田亮介, 福士龍之介, 佐々木祐典, 栗原康太, 山下敏彦, 本望修, 小原尚

脊髄損傷に対するBDNF遺伝子改変MSC由来エクソソーム (BDNF-MSCexo)単独の治療効果の検証と、MSCとBDNF遺伝子改変MSC由来エクソソーム (BDNF-MSCexo)の併用療法の治療効果を検証を行っている。本研究では、ラット用脊髄損傷作成装置(IH-0400 Impactor; PSI社製)を用いて、SDラットのTh9レベルに実験的SCI(脊髄損傷)を作製し、(遺伝子改変は脳由来神経栄養因子 (Brain derived neurotrophic factor: BDNF)を過剰発現するBDNF-MSCを用いている。実験1：MSC由来エクソソーム (MSC exo)とBDNF遺伝子改変MSC由来エクソソーム(BDNF-MSCexo)による治療効果の比較解析実験群1：SCI + MSCexo (DMEM 1.0ml) 実験群2：SCI + BDNF- MSCexo (DMEM 1.0ml) 解析方法として ①生化学的解析：投与前に、in vitroにおいて、MSCexo とBDNF-MSCexo 中に含まれるBDNFをELISA (BDNF E-max immunoassay system, Promega) 法で定量した。さらに、各実験群の動物の脊髄損傷周囲におけるin vivoにおけるBDNFを定量解析した。 ② 神経解剖学的解析代表的な脳脊髄神経回路である皮質脊髄路・網様体脊髄路・赤核脊髄路を用いて解析した。観察期間終了後（受傷29日後）に全身麻酔下に定位的に、AAV-CAG-GFPまたはAAV-CAG-Tdtomatoを脳の各神経回路のoriginまたは脊髄に微量インジェクション機器を用いて選択的に注入し、その後6週の待機期間を経て再構築される神経回路の解析を行った(Neurolucida、 MBF社、IMARIS, Zeiss社)。

骨髄幹細胞治療における機能活性モニタリングと機能予後バイオマーカーの開発

基盤研究(C)

研究期間:

2021年04月

2024年03月

中村秀之, 佐々木祐典, 佐々木優子, 本望修, 鵜飼亮, 横山貴裕

我々は、脳梗塞に対する骨髄間葉系幹細胞（Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓ：ＭＳＣ）の経静脈的投与(ＭＳＣ治療）による良好な治療効果を報告してきた。我々のこれまでの基礎研究において、ラット脳梗塞モデルを用いた実験を行い、ＭＳＣ治療後の血漿中ＢＤＮＦは、投与されたＭＳＣの機能的バイオマーカーとなりうる可能性があることを報告した (Nakamura et al., 2017) 本研究では、血漿中ＢＤＮＦの推移が、機能活性の指標に留まらず、脳梗塞の機能予後と相関するのかどうかを検証することを計画しており、さらに、機能活性や機能予後を示す新しいバイオマーカーを探索することを目的としている。これまでに、①医師主導治験患者の血漿中ＢＤＮＦ測定、および、②ラットＭＣＡＯモデルにＭＳＣを投与し、血漿中ＢＤＮＦと機能予後の相関を検討することで、ＭＳＣ治療における機能活性モニタリングによる機能予後バイオマーカーの開発を行っている。①では、札幌医科大学附属病院に入院した患者から、経時的に採血を行い、血漿を分離し、ELISA法にてＢＤＮＦを測定し、ELIZA法によるＢＤＮＦの測定は、ＢＤＮＦ E-max immunoassay system (Promega) を用いる。②では、ラット脳梗塞モデルとして、中大脳動脈永久閉塞（MCAO）モデルを用いる。MCAOモデルは、Intraluminal thread methodを用いて作製し、脳梗塞発症6時間後にラットＭＳＣを経静脈的に投与し、末梢血を採取し、保存血から血漿を分離し、①同様にELISA法にてＢＤＮＦを測定する。観察期間中、並行して、トレッドミルによってラットの最大走行速度を測定し、運動機能および動物用MRIを用いて脳梗塞の体積を経時的に評価する。観察期間終了時に、血漿中ＢＤＮＦと運動機能から機能予後解析を継続して行うこととしている。以上のように、補助金は適切に使用し、予定通り進行中である。

慢性期虚血性脊髄障害に対する骨髄間葉系幹細胞の治療効果の検討

基盤研究(C)

研究期間:

2021年04月

2024年03月

安田尚美, 佐々木祐典, 川原田修義, 本望修

虚血性脊髄障害は胸部・胸腹部大動脈瘤の外科治療における非常に重篤な合併症であり、様々な予防法が行われているが、発症頻度も10～20％と高く、根本治療法は無い。我々は、急性期虚血性脊髄障害モデルに対する骨髄間葉系幹細胞（mesenchymal stem cells: MSCs）の経静脈的投与の治療効果を報告した。しかしながら、実臨床においては術後リハビリテーションを継続している慢性期虚血性脊髄障害患者が多く存在している。また、外傷性脊髄損傷に関しては、急性期に加えて、既に慢性期においてもMSCの経静脈的投与によって運動機能の回復効果を報告している。今回、我々は慢性期虚血性脊髄障害モデルを用いてMSCの経静脈的投与が治療効果をもたらすかどうかを検証する。本研究では、急性期虚血性脊髄障害モデル同様に慢性期においても外科的にラットを用いて作製できる虚血性脊髄障害モデルがないためモデルの作製から開始した。ラットを使用し全身麻酔下で左開胸を行い下行大動脈を遮断することで脊髄虚血を誘導した。急性期虚血性脊髄障害モデルよりもさらに長期の生存期間が必要になるため、急性期モデルのプロトコールを踏まえて、遮断部位や遮断時間、酸素投与量や体温等の術中管理を再調整し、下肢の運動障害を残しつつも長期に生存できるモデルの確立を行った。また観察期間中に感染などの合併症が起こらないように術後管理方法も再検討した。この１年ではモデル作成プロトコールの調整を行い安定したモデル作製が可能となった。また、３か月以上の経過観察において虚血性脊髄障害モデルラットの後肢運動麻痺は継続して認められていた。MSCを投与した群においては後肢の運動機能が回復する傾向を認めている。

神経障害性疼痛に対する間葉系幹細胞の治療効果の検討

基盤研究(C)

研究期間:

2021年04月

2024年03月

福士龍之介, 山下敏彦, 本望修, 佐々木祐典, 佐々木優子, 黄金勲矢, 廣田亮介, 押切勉, 栗原康太, 小原尚

神経障害性疼痛は、神経障害の存在下に神経応答の過敏性が発現することにより生じる痛覚過敏、allodynia、自発痛のことを称し、整形外科で多い愁訴であるが、一般的な治療法では十分な除痛効果が得られない症例も存在する。我々は、末梢神経損傷モデルを含む種々の神経損傷モデルに対し、骨髄間葉系幹細胞 (mesenchymal stem cells: MSC) の静脈内投与（MSC治療）が治療効果を有することを報告してきた。本研究は、骨髄間葉系幹細胞 MSC治療により誘導される神経障害性疼痛の抑制効果の解析、MSC治療後の神経障害性疼痛に関する全神経系のダイナミックな変化の解析を目的にしている。実験方法としては、末梢神経障害モデルとして汎用されているSpared nerve injuryモデルを用いた。モデル作製後3日目にラットから採集・培養したMSCを経静脈的に投与し、観察期間終了後 (28日)まで飼育した。MSC投与群10匹、Vehicle投与群10匹、Sham群10匹を評価対象とし、投与後3、7、14、21、28日目に行動学的評価を行った。評価方法は後肢足底部中央にfilament を用いて機械刺激を与えるvon Frey filament test、後肢足底部中央に熱刺激を加え, 逃避反応時間を測定するRadiant heat testを用いた。覚醒下でvon Frey filamentによる触刺激と heat padによる熱刺激を後肢足底に加え、各刺激に対する逃避反応を観察し、allodyniaやhyperalgesiaの有無から、疼痛行動の抑制効果を評価した。本年の研究成果に関して、MSC投与後7、14、21、28日目のvon Frey filament test 、Radiant heat testによって、逃避反応閾値、時間を測定した結果、MSC投与群はVehicle投与群、Sham群と比較して、疼痛行動は抑制される可能性があることが判明した。

実験的脳梗塞に対する骨髄幹細胞移植によって再構築される神経回路の網羅的解析

基盤研究(C)

研究期間:

2021年04月

2024年03月

長濱宏史, 佐々木祐典, 本望修, 横山貴裕, 鵜飼亮

我々は、これまでに実験的脳梗塞に対する骨髄間葉系幹細胞 (mesenchymal stem cells: MSCs)の経静脈的投与 (MSC治療)が、自然回復で得られる運動機能を凌駕する改善に貢献するメカニズムとして、脳の神経可塑性を賦活化することを明らかにしてきた。特に最近、左右大脳皮質運動野における脳梁を介した神経線維連絡が損傷から保護されることをEx vivo MRI Diffusion Tensor Tractography (DTT) および、順行性神経軸索トレーサーによる神経解剖学的トレーシング法を用いた解析手法によって報告した。これらの成果から、我々は、実験的脳梗塞に対するMSC治療後の脳内には明らかな新規の神経回路の再構築が惹起されることを見出した。本研究では、実験的脳梗塞に対するMSC治療後の局所の神経線維連絡の再編にとどまらず、全脳の網羅的なコネクトーム解析を行い、神経線維ネットワークを最新のmagnetic resonance imaging (MRI)技術と神経解剖学的手法を用いて解析し、再構築される神経回路の全貌の解明を目指している。以上のように、補助金は適切に使用し、研究は予定通り進行中である。

脊髄障害性疼痛に対する骨髄間葉系幹細胞を用いた治療法の開発

基盤研究(C)

研究期間:

2021年04月

2024年03月

栗原康太, 福士龍之介, 廣田亮介, 佐々木祐典, 山下敏彦, 押切勉, 岡真一, 佐々木優子, 本望修, 小原尚

従来の脊髄損傷に対する研究は、運動機能の回復に焦点が置かれてきたが、近年は脊髄損傷に伴う二次的影響への関心が高まり、特に疼痛を含む異常感覚への治療介入によって、ADLやQOLが改善できると認識されつつある。しかし、その疼痛は難治性で、有効な治療法が確立されていないのが現状であり、新しい治療法の開発が期待されている。我々は、種々の中枢神経損傷モデルに対し、骨髄間葉系幹細胞(mesenchymal stem cells: MSC) の静脈内投与（MSC治療）が治療効果を有することを報告してきた。本研究の目的は、MSC治療が脊髄障害性疼痛に対し有効な治療法となり得るか検証することである。実験方法としては、ラット用脊髄損傷作製装置を用いて、SDラットのTh9レベルに実験的脊髄損傷を作製し、モデル作製後3日目にラットから採集・培養したMSCを経静脈的に投与し、観察期間終了後まで飼育した。投与後の行動学的評価を経時的に行った。評価方法は、Basso Beattie Bresnahan (BBB)、後肢足底部中央にfilament を用いて機械刺激を与えるvon Frey filament test、後肢足底部中央に熱刺激を加え, 逃避反応時間を測定するRadiant heat testを用いた。本年の研究成果に関して、MSC投与後のBBB、von Frey filament test 、Radiant heat testによって、逃避反応閾値、時間を測定した結果、MSC投与群はVehicle投与群、Sham群と比較して、運動機能の改善が得られ、疼痛行動は抑制される可能性があることが判明した。

脊髄損傷に対する骨髄間葉系幹細胞移植による、脳脊髄での可塑性亢進メカニズムの解析

基盤研究(C)

研究期間:

2021年04月

2024年03月

岡真一, 佐々木祐典, 横山貴裕, 本望修, 鵜飼亮

令和3年度、当院にMSC治療を目的に入院した脊髄損傷症例は、おおよそ20例を数え、順調に症例数を積み重ねている状況である。全ての脊髄損傷症例の脳、脊髄のMRIデータを検証した。撮像時期は、原則、入院時、投与直前、投与1ヶ月後、投与3ヶ月後、投与6ヶ月後の時点としていたかが、投与条件に当てはまらず投与を受けなかった症例や入院病床の調整の関係で、MRIの撮像を出来ない症例も散見された。特に脳DTIデータを用いたコネクトーム解析では、標準化の方法、使用する脳atlasの選択、ROI間の接続強度の閾値設定など、症例間でばらつきのない均一な解析を実施するためのパラメータの設定の検討を引き続き実施している。さらに、T1WI、T2WIなどを用いて大脳皮質厚や体積などの構造学的なデータ解析も同時に実施し、コネクトーム解析で得られた結果との比較も実施している。また、脊髄MRIでは、個々の症例においてDTI解析の可否や、定量的な解析を実施し、データの蓄積を行っている。撮像データの解析、特にDTIデータの解析を目的として高機能のパーソナルコンピューターを別途購入し、専用のアプリケーションにて解析を実施した。ラット脊髄損傷モデルに対して骨髄間葉系幹細胞(MSC)の経静脈投与することによって、中枢神経系にどのような神経回路の再構築(plasticity)が生じるかを検証するため、ラット胸髄Th9レベルの脊髄損傷モデルを作成し、動物用MRIでの撮像条件の最適化を検討した。8-9週齢のSDラットを購入し、ラット用脊髄損傷作成装置(IH-0400 Impactor; PSI社製)を用いて、安定した損傷部位を作成できることを確認した。その後、動物実験用高磁場MRI装置にて、脳、脊髄おける各種プロトコール(T1、T2、DTI等)での撮像を行い、撮像条件の調整を行い最適な撮像条件の検討を行った。

脳梗塞に対する骨髄幹細胞治療における分子メカニズムに基づく至適リハビリ条件の探索

基盤研究(C)

研究期間:

2020年04月

2023年03月

佐々木雄一, 佐々木祐典, 岡真一, 佐々木優子, 本望修, 山下達郎, 鵜飼亮

近年、骨髄間葉系幹細胞(MSC)を用いた細胞療法(MSC治療)は、再生医療の分野で脳梗塞や脊髄損傷に対する新しい治療方法として注目されている。我々は、既にラット脳梗塞モデルに対するMSC移植にリハビリを併用すると、リハビリ単独群やMSC移植単独群よりも、さらに高い運動機能の回復が得られるこという報告をした。MSCは、1)梗塞巣周囲に集積し、2)脳梗塞体積を減少させ、3)脳梗塞周辺領域のシナプス新生を誘導し、4)脳梁萎縮を抑制、するが、リハビリを併用すると、脳の可塑性のさらなる亢進を誘導することが可能となり、より高い治療効果が得られることを明らかにした。しかし、実臨床に目を向けると、MSC治療とリハビリの至適なプロトコルの確立はなされておらず、様々な議論が絶えない状況である。一方、最近のリハビリの動向として、早期リハビリや高負荷・高頻度のリハビリの有用性、さらに、日常生活における適切な環境因子に注目が集まっている。本研究は、MSC移植に併用する適切な運動(リハビリ)の種類や頻度・強度とともに、飼育環境も考慮し、回復経過を分子メカニズムなど様々な視点から詳細に比較解析することで、MSC移植の治療効果を最大限に引き出すための新しいリハビリ方法を確立することを目的としている。特に、運動強度と運動時間をなどの負荷量に注目し、脳の可塑性のパターンの変化、神経回路の再構築、シナプス新生などの観点から解析を進めている。現在までに、本研究費によって、各運動負荷における実験的脳梗塞に対する治療効果の行動学的解析、MRI解析、神経トレーサーを用いた神経解剖学的解析などを行っている。以上のように、補助金は補助条件に従って、有効に使用されている。

早産児脳障害に対する骨髄間葉系幹細胞を用いた新規治療法の開発

基盤研究(C)

研究期間:

2020年04月

2023年03月

寺田光次郎, 川崎幸彦, 佐々木祐典, 福村忍, 小林正樹, 坂井拓朗, 本望修, 飯塚裕典

我々は、予備実験において、胎生18日目の妊娠SDラット（妊娠期間：21日）に対して、エンドトキシンであるリポポリサッカライド（LPS）を腹腔内投与し、出生した日齢7の新生仔ラットに左総頚動脈結紮・低酸素暴露をすることで、脳室周囲の白質に虚血領域を呈する脳室周囲白質軟化症（Periventricular leukomalacia：PVL）モデルラットを作成した。PVLモデルラットは、低酸素虚血単独群（左総頚動脈結紮・低酸素暴露のみ、母体LPSなし）と比較して、大脳の虚血容積が増大し、重症になることが判明した。本研究では、PVLモデルラットに対して、別の成体ラットより採取、培養した骨髄間葉系幹細胞（Mesenchymal stem cell：MSC）を経静脈的に投与し、急性期MSCの治療効果と作用メカニズム、特に発達脳における神経保護効果や神経可塑性の亢進について検証している。日齢10のPVLモデルラットを、MSC群とVehicle群に振り分け、MSCまたはDMEM（培養液のみ、細胞なし）を経静脈的に投与した。運動機能の評価としてロータロッド試験、シリンダー試験、空間認知機能の評価としてモリス水迷路試験を用いて行動学的解析を実施した。これまでに、MSC群で良好な結果が得られており、MSC治療の有効性を確認した。また動物用7T-MRIを用いて、MSC投与前後における大脳の虚血体積および残存大脳容積、脳血流の変化について検証した。観察期間終了後の脳組織を用いて、拡散テンソル画像による神経線維の評価、免疫化学染色による神経細胞や脳の髄鞘化の動向について検証している。

脊損に対する骨髄幹細胞治療後の網羅的遺伝子解析による“脳および脊髄の反応”の解明

基盤研究(C)

研究期間:

2020年04月

2023年03月

押切勉, 廣田亮介, 山下敏彦, 岡真一, 佐々木優子, 本望修, 栗原康太, 福士龍之介

我々は脊髄損傷患者に対する自己骨髄幹細胞(MSC)の静脈的投与を行った医師主導治験において、脳のMRI diffusion tensor imaging (DTI)を用いたコネクトーム解析を行い、脳のplasticityが亢進していることを見出した。さらに、最近では、脊髄損傷ラットモデルにMSC移植を行い、運動機能の回復が現れた移植3日目に大脳皮質運動野の網羅的遺伝子解析を行った結果、複数の遺伝子の発現量に変化があり、これらの遺伝子の多くは神経再生、plasticityの亢進に関与する遺伝子であることを報告した(Oshigiri et al.,2019)。そこで本申請では、先行研究を発展させ、大脳皮質の更なる解析に加えて脊髄損傷局所の網羅的遺伝子解析を複数の観察ポイントで行い、運動機能の改善に関与する遺伝子のプロファイルを解析し、中枢神経系全体の遺伝子発現の変化を総合的に考察することで、次世代の治療法に展開させることを目的とする。現在までに、本研究費によって、ラット脊髄圧座モデルを作成し、MSCを左大腿静脈より投与し、下肢運動機能の行動解析をBBBscore行い、投与群の優位性を認めた。移植後3日目および7日目の大脳皮質運動野のMicroarrayによる網羅的遺伝子解析を行っている。これまでのところ、移植後7日目と比較して、3日目の大脳皮質の遺伝子が大きく変化しており、運動機能回復に関連した遺伝子がいくつか判明され、その経時的な変化の解析を行っているところである。また、脊髄及び脳の組織から得られた複数タイムポイントの遺伝子情報を元に、複数のデータベース（Gene Ontology解析、パスウェイ解析、エンリッチ解析、タンパク質相互作用解析、プロモーター解析）を用いて、統合的に遺伝子発現解析を行う。以上のように、補助金は補助条件に従って、有効に使用されている。

神経膠腫の浸潤機序解析と浸潤能を標的とした先駆的治療法の開発

基盤研究(C)

研究期間:

2020年04月

2023年03月

鰐渕昌彦, 川端信司, 佐々木祐典, 平松亮, 池田直廉, 古瀬元雅, 野々口直助, 佐々木優子, 本望修

アクチンのisoformは６種類が知られている。それらのうち、肥大型心筋症との関連や心室中隔欠損症の責任遣伝子として注目されているのがACTC1（actin, alpha cardiac muscle 1）である。我々はACTC1が悪性脳腫瘍、特にグリオーマの予後や浸潤能に関与することを見出した。本研究ではACTC1の更なる役割を解明し、遺伝子ネットワークの解析や治療薬の開発に繋げることを目的としている。TCGA PanCancer Cell line Atlasに登録されている1,156種類のがん細胞株における遺伝子発現データを解析した結果、ACTC1は「上皮間葉転換」の主要なマーカー遣伝子であるFN1、SNAI1、ZEB1、TWIST1、VIM、FOXC2の発現量と相関があることを確認したので、ACTC1の発現と上皮間葉転換との関連について研究を行っている最中である。また、ACTC1のプロモータ配列に対し親和性の高い転写因子として、転写因子のデータベースより、SMARCA4、RB1、POLR2A、CBFA2T2、WT1、GLIS1が相関することを確認した。さらにヒトグリオーマ細胞株８株を用いてtranscriptome解析を行った後、ACTC1の発現量と共変動を示す遺伝子を対象としてpathway解析を実施した.結果、Rap1、Hippo、Relaxin、Apelin、Sphingolipid、C-type lectin receptor及びOxytocinのsignaling pathwayがACTC1の発現に有意な関連を持つsignaling pathwayとして同定された。同様の手法を用いて、高悪性度髄膜腫や転移性脳腫瘍など、他の悪性脳腫瘍の細胞についてもACTC1の発現や役割の解析を行っている。

脊髄損傷に対する骨髄幹細胞治療でダイナミックに再構築された神経回路の機能解析

基盤研究(B)

研究期間:

2020年04月

2023年03月

佐々木祐典, 廣田亮介, 栗原康太, 小原尚, 横山貴裕, 押切勉, 岡真一, 佐々木優子, 寺島嘉紀, 本望修

我々は脊髄損傷動物モデルに対する骨髄間葉系幹細胞(mesenchymal stem cells: MSC)の経静脈的投与による機能回復のメカニズムとして、“損傷局所”における神経保護作用、血液脊髄関門の安定化、損傷軸索のsproutingや、損傷軸索の再生、再有髄化、シナプス新生等が多段階的に作用することにより、運動機能の回復に貢献することを明らかにしてきた。これらのメカニズムに加えて、損傷周囲および脳における神経回路のダイナミックな再構築によって、“中枢神経系全域の再生・plasticityの賦活化”が惹起される、という治療メカニズムも強く寄与している可能性があるのではないか、という仮説を検証することを目的としている。本研究では、実験的脊髄損傷に対するMSC治療後に惹起される損傷周囲および脳における神経回路の再構築を、順行性神経軸索トレーサーによる神経解剖学的トレーシング法、Ex vivo MRI Diffusion Tensor Tractography (DTT)などを駆使して、解明する予定である。特に、神経解剖学的解析においては、共焦点レーザー顕微鏡(Zeiss)、光シート顕微鏡（ミルテニーバイオテク）により画像を取得し、高精細3D/4D画像解析ソフトを用いた神経ファイバーのトレーシング、ヒートマップ解析等を行っている。これら一連の実験により、実験的脊髄損傷に対するMSC治療によってダイナミックに再構築された神経回路の解析を行うことが可能になると考えている。以上のように、補助金は適切に使用されている。

骨髄間葉系幹細胞移植を用いた難治性てんかんに対する新規治療法の開発

基盤研究(C)

研究期間:

2019年04月

2022年03月

福村忍, 佐々木祐典, 本望修, 寺田光次郎

本研究では、既にてんかんをきたした慢性期けいれん重積動物モデルに対して、骨髄間葉系幹細胞（Mesenchymal stem cell: MSC）治療を行うことで、てんかんの抑制効果を有するかを検討した。リチウム-ピロカルピンによるけいれん重積後にてんかんを発症したラットに対して、けいれん重積後60日目に、MSCもしくはvehicle（DMEMのみ、細胞なし）を経静脈的に投与した。MSC投与群はvehicle投与群に比べ、てんかん発作減少効果およびガンマ帯域の減少効果を認めた。MSCは、けいれん重積後の慢性期のてんかんに対し、けいれん数および脳波上の興奮性を軽減させるに有効であると考えられた。

骨髄幹細胞の自己治癒能と全身の恒常性維持による健康寿命延長

基盤研究(C)

研究期間:

2019年04月

2022年03月

佐々木優子, 佐々木祐典, 小野寺理恵, 岡真一, 本望修, 鵜飼亮, 横山貴裕

超高齢化社会を迎える日本にとって、老化メカニズムを解明し、健康寿命を延長することは最重要課題である。骨髄間葉系幹細胞は、損傷時における治癒プロセスに貢献しており、既に複数の疾患をターゲットとした臨床応用が試みられている。我々は、これまでの研究から、老化により生体内の間葉系幹細胞が機能低下を起こすことが、個体の老化の原因となっているとの仮説を立て、神経疾患動物に対して、ラットから採取したＭＳＣを経静脈的に投与した結果、寿命の延伸効果が得られることを報告した。本研究の成果により、健康寿命の延長が可能となれば、超高齢化社会を迎えているわが国において、大きな福音となり、波及効果は極めて高いと思われる。

脳梗塞に対する骨髄幹細胞移植による神経回路の再構築における分子メカニズムの解明

基盤研究(C)

研究期間:

2019年04月

2022年03月

本望修, 佐々木祐典, 小野寺理恵, 岡真一, 佐々木優子

我々は急性期脳梗塞モデルを用いて骨髄幹細胞(mesenchymal stem cell: MSC)の経静脈的投与が治療効果を発揮し、そのメカニズムに両側の大脳皮質運動野を結ぶ神経線維が増加し、神経可塑性の亢進があることを報告した。本研究では、神経可塑性の亢進は、局所にとどまらず全脳においても誘導されていることを見出した。MSCによって惹起された全脳における神経可塑性の亢進が治療効果の向上に貢献することが判明したことで、今後の更なる治療方法の開発につながると思われる。

実験的脊髄損傷後に生じる脳における可塑性の骨髄間葉系幹細胞による亢進作用の解析

基盤研究(C)

研究期間:

2018年04月

2021年03月

長濱宏史, 鈴木淳平, 佐々木祐典, 中崎公仁, 本望修

脊髄損傷モデルに対するMSC治療によって生じる、損傷局所および損傷上位脊髄および脳における神経可塑性の賦活化は、損傷局所の白質および灰白質の神経損傷、軸索の損傷または変性を保護すること、血液脊髄関門を安定化することが寄与すると考えられた。さらに、MSC治療後に大脳皮質運動野の網羅的遺伝子解析を行った結果、複数の遺伝子の発現量に変化があり、神経再生・神経可塑性の賦活化に関与する可能性があることが判明した。従って、脊髄損傷に対するMSC治療によって、損傷局所および損傷上位脊髄および脳に惹起される神経可塑性の亢進が、運動機能の改善に関与している可能性を明らかにした。

血液脊髄関門の破綻に注目した新規ALS動物モデルの開発と骨髄幹細胞による治療

基盤研究(C)

研究期間:

2018年04月

2021年03月

小野寺理恵, 佐々木祐典, 岡真一, 佐々木優子, 本望修

筋萎縮性側索硬化症 (ALS)動物モデルに対して、骨髄間葉系幹細胞（MSC）を経静脈的に投与した結果、有意に病状の進行を抑制した（運動機能低下および脊髄運動神経細胞の減少、血液脳関門の破綻が抑制）。さらにMSC治療群は神経栄養因子NeurturinのmRNAの発現量が高くMSCの治療効果の1つであることが示唆された。これらの結果からMSCは血液脳関門の破綻を抑制し、神経栄養因子（Neurturin）を分泌することで運動神経保護作用が示唆され、ALS治療の1つとして有用であると推察された。さらに、MSCを複数回投与した結果、単回投与に比べて、有意に病状の進行は抑制され、寿命延伸効果が得られた。

術後虚血性脊髄障害に対する間葉系幹細胞を用いた治療法の開発

基盤研究(C)

研究期間:

2018年04月

2021年03月

安田尚美, 佐々木祐典, 川原田修義, 本望修

虚血性脊髄障害モデルラットに対する骨髄間葉系幹細胞（Mesenchymal Stem Cells : MSCs）の経静脈的投与が治療効果を検討した。モデルラットに運動障害発症１日後にMSCを投与し２８日間観察して非投与群と運動機能を比較した。結果、MSC投与群では非投与群と比較し有意な運動機能の改善が認められた。また、MRIを用いた経時的観察においても脊髄体積の保持を認めた。組織学的検討においては、MSC投与群において、脊髄の断面積の保持、神経細胞数の保持、神経線維数の保持、微小血管系の保持を認めた。これらにより、治療メカニズムとして神経保護と血液脊髄関門の安定化が示唆された。

間質性膀胱炎に対する骨髄幹細胞移植による革新的治療法の開発

基盤研究(C)

研究期間:

2018年04月

2021年03月

田端秀敏, 舛森直哉, 佐々木祐典, 本望修

ハンナ型間質性膀胱炎を想定したToll-like receptor7（TLR7)刺激ラットモデルを作製した。TLR7刺激薬（Loxisolivin；LX）を膀胱内注入した24時間後に骨髄幹細胞もしくは細胞なしの培養液をラットに経静脈的に投与した。投与3日後に間質性膀胱炎症状（疼痛行動、排尿行動）と病理組織学的に炎症所見を評価した。骨髄幹細胞投与群は培養液投与群と比較して、疼痛、排尿回数、1回排尿量の悪化が抑制された。また、浮腫、出血、好中球浸潤などの炎症所見の悪化も有意に抑制された。

脊髄損傷に対する骨髄間葉系幹細胞移植による、上位中枢神経における可塑性亢進の解析

基盤研究(C)

研究期間:

2018年04月

2021年03月

岡真一, 本望修, 佐々木祐典, 佐々木優子, 中崎公仁, 鈴木淳平, 長濱宏史

脊髄損傷等の神経損傷に対して自家骨髄間葉系幹細胞(MSC)を経静脈的投与することによって、神経機能が回復することが明らかとなっている。投与した細胞の作用は、損傷部位の局所的修復のみならず、より上位の脊髄、脳を賦活するメカニズムが考えられている。今回我々は、ヒトおよび動物実験モデルにおける脊髄損傷に対するMSC投与後のMRI解析、動物モデルについては組織学的解析を同時に実施し、神経回路の再編成が生じていることを明らかとした。

脊損に対する骨髄幹細胞移植における介在ニューロンにより再構築される神経回路の解析

基盤研究(C)

研究期間:

2018年04月

2021年03月

廣田亮介, 佐々木祐典, 押切勉, 森田智慶, 寺島嘉紀, 中崎公仁, 岡真一, 佐々木優子, 山下敏彦, 本望修

これまでに脊髄損傷後に生じる脳内の神経回路の再構築が、MRI diffusion tensor imagingなどを用いて報告されているが、詳細な神経解剖学的手法を用いた報告は少ない。本研究の目的は順行性神経トレーサーとして知られるアデノ随伴ウイルス（AAV）を用いて、脊髄損傷後の脳内における神経回路の再構築を詳細に解析した。 CAGプロモーターを搭載したAAV-8は、脳内における形質導入効率、順行性追跡能、細胞選択的標識能が高いことが判明した。さらに、同ベクターを用いて、脊髄損傷後の脳を解析した結果、神経回路の再構築が生じていることが示唆された。

悪性神経膠腫に対する浸潤能の分子メカニズムの解明と制御による革新的治療法の開発

基盤研究(C)

研究期間:

2017年04月

2020年03月

鰐渕昌彦, 佐々木祐典, 三上毅, 三國信啓, 小松克也, 中崎公仁, 本望修

原発性脳腫瘍のうち、最多を占めるグリオーマは、集学的治療を施行しても完治困難である。その理由として浸潤能の強さが挙げられるが、関与する因子や機序は不明である。本研究で、予後と関与する因子として、ACTC1（actin alpha cardiac muscle 1）、 SERPINEA1、IL13 receptor alpha 2を同定し、さらにACTC1は悪性グリオーマの浸潤能に深く関わる因子であることを見出した。また、ACTC1の発現を抑制することで、グリオーマ細胞の遊走能が有意に抑制されることが判明した。浸潤に関与する因子を治療の標的とすることで、グリオーマの予後改善が期待できる。

慢性期脊損に対する骨髄幹細胞移植によるplasticity賦活化による機能回復

基盤研究(C)

研究期間:

2017年04月

2020年03月

森田智慶, 佐々木祐典, 押切勉, 廣田亮介, 中崎公仁, 鰐渕昌彦, 本望修, 山下敏彦

われわれはこれまでに、急性期から慢性期にかけての脊髄損傷(SCI)動物モデルに対して骨髄間葉系幹細胞(MSC)を経静脈的に移植し、運動機能の回復が得られることを報告してきた。 MSC移植を行った脊髄損傷ラットモデルに対して、大脳皮質運動野から抽出したmRNAの網羅的遺伝子解析を行ったところ、複数の遺伝子の発現量に変化が見られ、これらの遺伝子の多くは神経再生、plasticityの賦活化に関与する可能性がある遺伝子であることを発見した。特にコントロール群と比べてMSC治療群で発現が高かった7個のcoding遺伝子の発現量は、運動機能(BBBスコア)と高い相関があることが判明した。

脳梗塞に対する骨髄幹細胞移植による脳のplasticity亢進による神経機能回復

基盤研究(C)

研究期間:

2017年04月

2020年03月

鈴木淳平, 佐々木祐典, 長濱宏史, 中崎公仁, 本望修

実験的脳梗塞に対してMSCを経静脈的に移植した結果，運動機能の改善が得られることが判明した．神経機能の回復をもたらすMSCの治療メカニズムとして，投与したMSCによって脳の機能的代償変化が賦活化されるとともに，特に左右大脳半球を結ぶ神経線維を損傷から保護することで，自然回復で得られる以上の運動機能の改善に貢献していることを報告した（Nagahama et al., Brain Res, 2018）．この結果から我々は，MSC治療によって，脳内には明らかな神経回路の再構築が惹起される可能性を見出した．

筋萎縮性側索硬化症に対する骨髄間葉系幹細胞移植による新たな治療法の開発

基盤研究(C)

研究期間:

2017年04月

2020年03月

小野寺理恵, 佐々木祐典, 本望修

脳梗塞に対する骨髄幹細胞とリハビリ併用による脳と脊髄のplasticityの解析

基盤研究(C)

研究期間:

2017年04月

2020年03月

佐々木雄一, 佐々木祐典, 本望修, 山下達郎

実験的脳梗塞に対するリハビリテーション（リハビリ）と骨髄間葉系幹細胞(mesenchymal stem cells: MSC)の経静脈内投与(MSC治療)の併用療法による治療メカニズムを検討した。MSC治療により、神経可塑性の亢進や血漿内BDNFの増加を認めた。これらの結果は、MSC治療の効果を判断する新たな指標になりうる可能性が考えられた。さらに、リハビリ併用群においても、同様の傾向が得られたことから、今後は、リハビリ併用による神経可塑性の検討を継続し、治療効果を最大限に引き出すリハビリプロトコルの確立に向けた研究を進める必要があると考えられた。

脊髄損傷に対する骨髄幹細胞移植直後からの神経機能回復のメカニズムの解析

基盤研究(C)

研究期間:

2016年10月

2019年03月

押切勉, 本望修, 山下敏彦, 佐々木祐典, 森田智慶

脊髄損傷(SCI)モデルに対する骨髄間葉系幹細胞(MSC)の経静脈内投与による機能回復が報告される一方、脊髄損傷における脳の働きが注目されている。本研究では、急性期SCIラットにMSCの経静脈的投与を行い、脳のMicroarrayによる網羅的遺伝子発現解析から、運動機能回復に関連した遺伝子が15つ抽出された。このことからMSCの静脈内投与により、脳の神経保護および神経再生作用を有し、運動機能回復に関与していることが示唆された。

海綿体神経損傷モデルに対する急性期骨髄幹細胞移植の有効性～勃起機能は回復するか～

基盤研究(C)

研究期間:

2016年04月

2019年03月

松田洋平, 舛森直哉, 佐々木祐典, 小林皇, 本望修

前立腺全摘除術後の勃起障害を想定した陰茎海綿体神経電気損傷ラットモデルを作製した。神経損傷３時間後に骨髄幹細胞もしくは培養液をラットに投与した。投与４週後に勃起機能を陰茎海綿体内圧で評価した。骨髄幹細胞投与群は培養液投与群と比較して勃起機能が良好であった。また、生理学的評価に加えて病理組織学的に両者の違いを比較し、いずれも骨髄幹細胞投与群で良好な結果であった。

脳海綿状血管腫に対する分子標的療法の開発

基盤研究(C)

研究期間:

2016年04月

2019年03月

能代将平, 佐々木祐典, 鰐渕昌彦, 三上毅, 三國信啓, 本望修

ステント留置後血管に対する骨髄幹細胞移植による内膜新生メカニズムの解析

基盤研究(C)

研究期間:

2016年04月

2019年03月

小松克也, 佐々木祐典, 鰐渕昌彦, 三上毅, 飯星智史, 三國信啓, 中崎公仁, 本望修

ステント留置(carotid artery stenting:CAS)後の再狭窄はステントstrutにおける炎症反応により惹起される内皮の過形成が原因と考えられ、脳梗塞再発の原因となる。一方、我々はこれまでに脳梗塞などの動物実験モデルに対する骨髄間葉系幹細胞の静脈内投与の治療効果を報告してきた。本研究では、実験動物にステント留置術を行い、内膜損傷モデルを作製した後に、骨髄間葉系幹細胞を経静脈的に投与し、血管内膜の状態を種々の方法で解析した結果、骨髄間葉系幹細胞の投与により、ステントstrutに対する炎症反応を抑制されることにより内膜の過形成が抑制されることが明らかになった。

再開通療法後の虚血脳再灌流障害に対する骨髄幹細胞による新しい治療法の開発

基盤研究(C)

研究期間:

2016年04月

2019年03月

本望修, 佐々木祐典, 浪岡愛, 中崎公仁, 浪岡隆洋

再灌流療法においては出血性合併症への注意が必要である。本研究では、MSCによってrtPAによる出血性合併症を抑制することを示した。中大脳動脈閉塞による一過性閉塞モデル（tMCAO）ラットを作製し、①生食+vehicle、②rtPA+vehicle、③生食+MSC、④rtPA+ MSCの4群に分けた。②④群において、出血性合併症は抑制された。③④群は、行動学的機能を改善したが、④群のほうがより改善していた。②④群の脳血流は、再灌流直後ではほぼ同じであったが、①③群よりも高かった。MSC投与により、血管内皮機能の破綻が抑制により出血性合併症を減少させ、運動機能の改善に貢献することが示唆された。

骨髄間葉系幹細胞移植を用いた難治性てんかんに対する新規治療法の開発

基盤研究(C)

研究期間:

2016年04月

2019年03月

福村忍, 佐々木祐典, 本望修, 坂井拓朗

我々は、けいれん重積後にてんかんを生じる動物モデルに対して、けいれん重積後早期に骨髄幹細胞 (mesenchymal stem cell: MSC)を経静脈的に移植することにより、けいれん数の減少、認知機能低下を抑制することを明らかにした。海馬の細胞数および苔状線維発芽の組織学的解析では、けいれん重積後の海馬細胞数減少およびGABAニューロン数減少は、MSC投与により抑制されていた。またマンガン造影MRIおよびTimm染色のいずれにおいても、MSC投与により異常苔状線維発芽の減少を認めた。MSCは、けいれん重積後のてんかん発症を予防および認知機能保持に有効であると考えられた。

実験的脊髄損傷に対する骨髄幹細胞移植におけるエクソソームを介したペリサイトの再生

基盤研究(C)

研究期間:

2016年04月

2019年03月

佐々木祐典, 鳥越俊彦, 本望修, 浪岡愛, 中崎公仁, 浪岡隆洋, 押切勉, 廣田亮介, 佐々木優子, 岡真一

SCIに対してMSCを経静脈的に移植した結果、運動機能の改善が得られることが判明した。運動機能の改善が得られた動物の脳組織からmRNAを抽出し、マイクロアレイ解析によってスクリーニングされた遺伝子のうち、運動機能スコアであるBBBスコアと相関のある遺伝子を”behavior associated DEGs”として同定した。大脳皮質における特定の遺伝子発現の一過性の変化により、運動機能回復に関与していることが示唆された。MSCは経静脈的な全身投与により、脊髄局所だけでなく脳に対しても運動機能回復を促進させる効果があると考えられた。

脳血管性認知症に対する骨髄間葉系幹細胞移植による治療効果の検討

基盤研究(C)

研究期間:

2015年04月

2018年03月

中崎公仁, 佐々木祐典, 小野寺理恵, 鰐渕昌彦, 三上毅, 浪岡隆洋, 浪岡愛, 本望修

近年、骨髄間葉系幹細胞(MSC)静注療法の臨床応用が進んでいる。本研究では、MSC静注療法が脳血管性認知症に対する治療効果を有するのかを検証した。Spontaneously hypertensive rats stroke-proneラット（SHRSP）を用いて、Vehicle群と比較検証した。認知機能が低下しているSHRSPに対して、21週にMSCを静脈投与した。介入後5週まで解析した結果、MSC群は、Vehicle群と比較して、有意に認知機能が高かった。また、MSC群において、大脳皮質と海馬の萎縮が抑制されていた。MSC静注療法は脳血管性認知症に対して、治療効果を有する可能性が高い。

慢性期脊髄損傷に対する骨髄間葉系幹細胞移植による革新的治療法の開発

基盤研究(C)

研究期間:

2014年04月

2017年03月

森田智慶, 本望修, 佐々木祐典, 中崎公仁, 竹林庸雄, 鰐渕昌彦, 山下敏彦, 押切勉

ラット脊髄損傷モデルの慢性期に対し骨髄間葉系幹細胞(MSC)の経静脈的移植を行い、治療効果を検討した。T9高位の脊髄を圧挫し、重度脊髄損傷モデルを作製した。損傷10週後にMSCを経静脈的に移植した。後肢の麻痺は移植翌週から改善が見られ始め、対照群よりも有意な回復を得た。移植したMSCの数%が損傷部に集積した。血液脊髄関門の機能は、損傷後11週が経過していても不安定であったが、MSCの移植により速やかに安定し、このことが移植後早期の麻痺の回復に寄与していると考えられた。また、微小血管系の新生、損傷軸索の側枝形成、脱髄軸索の再有髄化などを認め、MSCの作用が多段階に生じていることを確認した。

発達脳に対する虚血および骨髄間葉系幹細胞移植の及ぼす影響の基礎的解析

基盤研究(C)

研究期間:

2014年04月

2017年03月

坂井拓朗, 本望修, 佐々木祐典, 中崎公仁, 福村忍, 小林正樹, 鰐渕昌彦, 浪岡愛, 浪岡隆洋

本研究は、新生児低酸素性虚血性脳症の動物モデル（HIEモデル）に対して骨髄間葉系幹細胞の移植の効果を組織学的、MRI、行動学的などを用いて評価した。HIEモデルラットは、日齢7のSDラットに対して左の総頸動脈の結紮術を行い、その後8％低酸素に120分間暴露させ作成した。細胞投与群には日齢10に予め採取・培養した骨髄間葉系幹細胞を経静脈的に移植した。移植群は対照群と比較し、beam walk testでの評価で行動学的に有意な運動能力の改善を認めた。さらにMRIにおいても移植群は対照群と比較し有意に改善を認めた。組織学的評価でも詳細な検討を行った。

ヒト由来の生体原料および試料の商業的な枠組みにおける使用について

挑戦的萌芽研究

研究期間:

2014年04月

2017年03月

石埜正穂, 本望修, 水谷修紀, 菅原桂, 飯田香緒里

本研究では、特に再生医療製剤の作製に必要な他家由組織を恒常的に調達するために、日本では何が欠けていて、それをどう克服すればよいかを模索した。医薬品として使用される生体組織の調達という点で、日本で動いている数少ない枠組みの１つは献血システムである。このシステムは公的な運営体制や教育の浸透に支えられて確立された。しかし、細胞治療等製品の場合は、血液製剤と異なり、材料の採取段階から製品ごとの多様なプロトコールに対応する必要があり、民間にこれを委ねざるを得ないものと考えられる。本研究では、他家再生医療の実現には、民間採取機関の法的な位置づけを明確にする制度の確立が最低限必要であるとの結論に達した。

骨髄幹細胞プロファイルの再構築と神経再生治療への応用

基盤研究(C)

研究期間:

2013年04月

2016年03月

本望修, 鰐渕昌彦, 佐々木祐典, 三上毅, 小林正樹, 中崎公仁, 坂井拓郎, 佐々木雄一, 鈴木淳平, 森田智慶, 浪岡愛, 浪岡隆洋

近年、再生医学の進歩によって、間葉系幹細胞（MSC）は、治療効果を有することが明らかになってきている。我々は、これまでにMSCをドナー細胞として、動物疾患モデルに対する移植実験を行い、良好な結果を得てきた。本研究では、ヒトおよびラット骨髄由来MSCの細胞生物学的性質を各種の分子細胞生物学的・生化学的・遺伝学的解析手法を用いて比較解析し、さらにラット骨髄由来MSCのin vivoでの治療効果を脳梗塞モデルを用いて解析を行った。

ヒト小型肝幹細胞移植の臨床応用に向けた基盤的臨床前研究

基盤研究(B)

研究期間:

2013年04月

2016年03月

平田公一, 三高俊広, 水口徹, 谷水直樹, 石井雅之, 本望修, 目黒誠, 川本雅樹, 巽博臣, 前佛均

臨床応用に向けたヒト小型肝幹細胞移植の実用化に向けての基盤的研究として、(1) ヒト小型肝幹細胞の分離・同定・保存・保存解凍後の細胞特性とその再現性の探索、(2) ヒト小型肝幹細胞の増殖・分化と再生反応亢進化について、人為的制御の可能性の探索、(3) ヒト小型肝幹細胞の動物肝への細胞移植、肝組織内に内在する小型肝幹細胞の分布・動態を探索、(4)ヒト小型肝幹細胞移植後の腫瘍化形成の有無に関する長期経過観察、を中心課題として研究し、下記の具体的成果を得た。

骨髄幹細胞移植による海綿体神経の保護・再生と勃起機能の温存

基盤研究(C)

研究期間:

2013年04月

2016年03月

高柳明夫, 佐々木祐典, 小林皇, 本望修

【目的】本研究では、前立腺全摘除術の特性を考慮し、海綿体神経(CN)損傷モデルを用いて、神経損傷前にMSCを静脈投与することが勃起機能の温存に寄与するかを検討した。また、投与した骨髄間葉系幹細胞（MSC）の動態を観察し、作用機序についての検討を行った。【方法】SDラット（雄、8週齢）のCNに機械的な損傷を加え、CN損傷モデルとした。勃起機能の評価として、CNを電気刺激して得られる海綿体内圧と動脈圧の比(ICP/AP)を用いた。正常ラットに対して、ICP/AP測定後に、ランダム化を行った。MSC群には1×106個（/1ml）のMSC、対照群にはDMEM (1ml)を経静脈的に投与し、その直後にCN損傷を作成した。損傷1時間および2週後にICP/APを測定し、勃起機能を評価した。PKH26を標識したMSC(PKH26-MSC)を用いて移植MSCの組織分布を評価した。また、骨盤神経節（MPG）でのGDNF、Neurturinの発現を定量リアルタイムPCR (qPCR)法で解析した。【結果】神経損傷1時間後のICP/APは、両群ともに損傷前のICP/APに比べて有意な低下を認め(P＜0.01)、MSC群のICP/APは対照群に比べて有意に高かった(p＜0.05)。損傷2週後のICP/APもMSC群では対照群に比べて有意に高かった(p＜0.01)。移植したPKH26-MSCが、MPG、CNに分布することを確認した。qPCR法では、MSC群ではMPG中のGDNFおよびNeurturinの発現が対照群に比べて有意に亢進していた。(p＜0.01, p<0.05) 【結論】MSCをCN損傷前に静脈投与することで、神経損傷後の勃起機能が温存された。投与されたMSCはMPGやCNに分布しており、神経栄養因子の発現が亢進することが神経保護作用を誘導する理由の一つであると推測された。

再生医療へ向けた組織別間葉系幹細胞の特性解析

基盤研究(C)

研究期間:

2012年04月

2015年03月

小野寺理恵, 本望修, 鰐渕昌彦, 佐々木祐典, 三上毅, 小林正樹, 中崎公仁, 坂井拓郎, 佐々木雄一, 鈴木淳平, 森田智慶

近年、再生医療で用いられる幹細胞は、既存の治療法を凌駕する複数のメカニズムで治療効果を発揮することが分かってきている。その中でも特に、間葉系幹細胞（MSC）は、移植のドナー細胞として、多疾患への臨床応用が期待され注目されている。本研究では、ヒト骨髄由来の間葉系幹細胞、ラットから採取した間葉系幹細胞の細胞生物学的性質を各種の分子細胞生物学的・生化学的・遺伝学的解析手法を用いて比較解析し、さらにラット骨髄由来間葉系幹細胞のin vivoでの治療効果を脳梗塞モデルを用いて解析を行った。

神経変性疾患に対する骨髄幹細胞移植による新規治療法開発の基礎研究

基盤研究(B)

研究期間:

2010年04月

2014年03月

下濱俊, 本望修

本研究では、自己の骨髄幹細胞による細胞移植治療が難治性神経変性疾患の制圧に向けた治療体系の新たな選択肢になりうるか否かを明らかにすることを目的とした。ヒト骨髄間葉系幹細胞の静脈内投与は6-OHDA線条体導入パーキンソン病モデルラットに対し，メタンフェタミン誘発異常旋回運動を抑制し， 6-OHDA誘導ドーパミン神経細胞死を有意に抑制していることが確認された。また，Iba1を用いたミクログリア活性比較解析においてヒト骨髄間葉系幹細胞移植によりミクログリア活性抑制効果が認められた。以上より，ヒト骨髄間葉系幹細胞はパーキンソン病の進行性の神経変性に対して神経保護作用を示す可能性があることが示唆された。

亜急性期の脳梗塞に対する遺伝子組換え骨髄幹細胞移植の検討

基盤研究(B)

研究期間:

2008年

2011年

本望修, 濱田洋文, 宝金清博

従来、"脳梗塞亜急性期における梗塞巣の損傷は完成してしまっており、既に不可逆的損傷を負ってしまっている、"と考えられていた梗塞巣が、実は、不可逆的変化に陥っていない脳組織が残存しており、治療の介入の余地が残されていることが推測されていた。本研究では、亜急性期の脳梗塞巣における病態生理を解析し、細胞治療による治療メカニズムを検討することで、新しい治療戦略を考案することができた。

遺伝子組換え骨髄幹細胞の静脈内移植による脊髄損傷治療の基礎的研究

基盤研究(C)

研究期間:

2008年

2010年

野中雅, 寶金清博, 本望修, 本望修

脊髄損傷モデルラットに対して、骨髄幹細胞を静脈内に移植すると、著明な治療効果が認められることが、画像診断学的、組織学的、および行動学的に確認された。また、治療メカニズムには、BDNFを介した神経保護作用が強く関与しており、遺伝子組換え骨髄幹細胞を投与することで損傷局所のBDNF濃度を上げることで治療効果が更に高まることが判明した。また、神経再生作用も一部関与していることが判明した。さらに、これらの細胞治療による効果は、脊髄損傷発症後の超急性期に治療した場合のみならず、1か月以上経過した亜急性期に治療を行っても効果が認められたことより、"Therapeutic time window"は比較的広いことが判明した。

脊髄損傷に対する間葉系幹細胞移植におけるジアシルグリセロールの神経再生への関与

基盤研究(C)

研究期間:

2007年

2009年

村上友宏, 寳金清博, 本望修, 本望修

脊髄損傷モデルラットに対して、骨髄間葉系幹細胞を静脈内に移植すると、著明な治療効果が認められることが、画像診断学的、組織学的、および行動学的に確認された。また、治療メカニズムには、BDNFを介した神経保護作用が強く関与しており、また、神経再生作用も一部関与していることが判明した。さらに、これらの細胞治療による効果は、脊髄損傷発症後の超急性期に治療した場合のみならず、1か月以上経過した慢性期に治療を行っても効果が認められたことより、"Therapeutic time window"は比較的広いことが判明した。

脊髄空洞症発症に関わる髄内微小循環の解明と新たな治療法の開発

基盤研究(C)

研究期間:

2007年

2009年

小柳泉, 寳金清博, 秋山幸功, 本望修, 本望修

脊髄空洞症の成因に関して、実験的および臨床例での検討を行い、脊髄内の微小循環と組織間液の動態が重要な役割を果たしていることを確認した。脊髄空洞症では、組織間液の増大が空洞周囲の実質に存在し、中心管周囲から後索下部など、中央部から周囲へ拡大するように分布していた。これらの髄内浮腫は、治療による空洞の縮小とともに消失した。髄内の静脈系からの組織間液の吸収障害が、空洞形成の本態であると考えられた。

遺伝子組換え骨髄幹細胞の静脈内移植による脳梗塞治療の基礎的研究

基盤研究(B)

研究期間:

2004年

2007年

本望修, 寶金清博, 濱田洋文

ラット脳梗塞モデルに対して、遺伝子組換え骨髄幹細胞を静脈内に移植することにより、脳梗塞の治療を目的とした基礎的研究を遂行した。 (1)ラット中大脳動脈閉塞モデルへの骨髄幹細胞移植における治療効果の機序の解明全身麻酔下に中大脳動脈を遮断することで、脳梗塞モデルとした。骨髄幹細胞を静脈内に移植した場合の治療効果の機序として、(1)局所のサイトカイン濃度が増大することによる神経保護作用、(2)血管新生の誘導、(3)アポトーシスの抑制効果、(4)抗浮腫効果、等が関係することが解明された。 (2)ラット中大脳動脈閉塞モデルへの遺伝子組換え骨髄幹細胞の移植実験サイトカイン遺伝子(BDNF,GDNFなど)および血管新生遺伝子(VEGF,/Angiopoietin-1,PIGFなど)を骨髄幹細胞に導入し、移植治療の効果を検討した結果、治療メカニズムを増強する遺伝子を導入することで、更なる治療効果の向上が見込めることが判明した。 (3)末梢血中の幹細胞の検討末梢血に存在する間葉系幹細胞の分離・培養・増殖する技術を確立し、脳梗塞ラットへの移植実験で、骨髄中に存在する間葉系幹細胞と同等の治療効果が期待できることを検証した。以上のように、補助金は補助条件に従って、非常に有効に使用されている

骨髄幹細胞の末梢血中への導引による脊髄損傷治療効果の基礎的解析

基盤研究(C)

研究期間:

2004年

2006年

野中雅, 本望修, 寶金清博

当該研究計画では、骨髄幹細胞を利用することで、脊髄損傷に対する新治療法を現実化するための基礎的研究およびトランスレーショナルリサーチを目的とした。骨髄中には神経再生に有用な骨髄間葉系幹細胞(bone marrow derived mesenchymal stem cell : bMSC)が存在することは判明していたが、末梢血中に同様の幹細胞(peripheral blood derived mesenchymal stem cell : pMSC)が存在するか否かは不明であった。しかし、骨髄幹細胞を骨髄より取り出し末梢血中に移植すると、末梢血循環にのって脊髄に到達し、治療効果が発揮されることは判明していた。当該研究で、(1)末梢血中に存在する幹細胞の基礎解析、(2)末梢血中に存在する幹細胞の神経系細胞へのin vitroおよびin vivoでの分化、(3)骨髄に固定されている骨髄幹細胞の末梢血中への動員、を研究し、末梢血に存在する幹細胞が脊髄損傷の治療に有効である成果を得た。

心肺停止・蘇生後脳症におけるアポトーシス検出画像の開発

萌芽研究

研究期間:

2004年

2005年

寶金清博, 小柳泉, 本望修, 三上毅, 鹿野恒

本研究では、心肺停止後の蘇生脳に起こる脳の変化を画像でとられ、その病理所見との比較を行うことで、予後診断へ役立てることを主目的としている。そこで、まず、高度脳虚血-再灌流モデルにおける、実験用高磁場MRIの検討を行った。また、臨床例における、心肺停止後の蘇生脳の画像、代謝を検討した。さらに、ラット心肺停止モデルにおいて、実験用高磁場MRIと早期病理診断(アポトーシス検出)との比較解析を行った。 1.実験高度脳虚血-再灌流モデルのMRI ラットの心肺停止後の蘇生後脳の状態をsimulationするモデルとして、ラットの中大脳動脈閉塞・再灌流モデルを用いて、高磁場(7テスラー)のMRI装置を用いて、画像撮像を行った。その結果、再灌流後、fractional anisotrophy image(FA画像)において、再灌流脳において異方性が早期に失われ、その後、そのanisotrophyを失った範囲において、梗塞の出現と慢性期において萎縮が進行することが示された。また、この部位において、magnetic resonance spectroscopy(MRS)を行うと、乳酸の出現とさらに正常状態では見られないlipidの出現が見られた。 2.人における蘇生後脳症のMRI・MRS 心肺停止後の蘇生後脳症で、予後不良例、良好例における、拡散強調画像、MRSの差異を検討した結果、予後良好例では、実験と同様に、anisotrophyが保持され、嫌気性代謝のマーカーである乳酸の出現が認められなかった。これに対して、予後不良例では、早期から異方性が喪失し、乳酸が出現することが示された。 3.ラット心肺停止モデルにおける実験用高磁場MRIと早期病理診断(アポトーシス検出)との比較解析ラットを用いて、心肺を完全停止(9分間)後、蘇生させるモデルを作成した。同モデルでは、発症早期において実験用高磁場MRI上、異常信号を捕らえることが出でき、また、早期病理診断では神経細胞がアポトーシスに陥っていることを確認している。以上より、心肺停止後の蘇生脳に起こる脳の病態生理的変化と、発症早期のMRI画像所見が相関することを突き止め、予後診断とともに、早期治療の効果判定に有用となると思われた。

神経幹細胞による筋萎縮性側索硬化症(ALS)の治療法の開発

基盤研究(C)

研究期間:

2002年

2004年

永野功, 阿部康二, 本望修

筋萎縮性側索硬化症(ALS)の病態解明をすすめるために、ALSにおける運動ニューロン死の機序について、ALSのモデル動物である変異型ヒトSOD1(G93A)トランスジェニック(Tg)マウスを用いて解析した。その結果、G93ATgマウスにおいては低酸素刺激に対するVEGFの誘導が阻害されていることを見出した。VEGFが運動ニューロン死に関与する可能性をさらに調べるために、ラット脊髄でVEGFの受容体Flk-1の発現をブロックし、さらに低酸素曝露を加えた。その結果、運動ニューロン死が誘導されることがわかった。これらの結果から、ALSの発症にVEGFの誘導障害が関与している可能性を示唆した。神経栄養因子IGF-1によるALS治療の可能性を調べるために、G93ATgマウスの脊髄腔内にIGF-1投与してその効果をみた。IGF-1投与にてマウスの寿命は11%程度延長し、運動機能も比較的に保持された。さらに、運動ニューロン数の減少も対照に比べ約57%程度少なかった。この結果をふまえて、ALS患者へのIGF-1髄注療法治験を実施した。その結果、IGF-1髄注は安全で忍容性が高いことと、ALSによる運動機能低下をわずかながら有意に阻害することを明らかにした。ついで、神経幹細胞によるALS治療の道筋を探るために、内因性の神経幹細胞を増殖、誘導することを試みた。G93ATgマウスの脊髄腔内にEGFとFGF2を投与することによって、神経幹細胞の数を増加することを観察した。これらの細胞はグリア細胞に分化するものが多かった。この結果から、内因性の神経幹細胞を誘導することによって運動ニューロン死を制御する可能性が示された。

遺伝子組み換え骨髄細胞移植による脳神経組織の機能的修復

基盤研究(B)

研究期間:

2002年

2003年

本望修, 濱田洋文, 宝金清博

遺伝子組み換え骨髄幹細胞の脳神経領域における治療効果を、下記の方法で解析した。 1.遺伝子組み換え細胞の作成 (1)骨髄幹細胞にhTERT遺伝子を導入し、不死化した。 (2)骨髄幹細胞にBDNF遺伝子を導入し、神経保護作用を増強させた。 (3)骨髄幹細胞にIL-2遺伝子を導入し、抗腫瘍作用を増強させた。 2.上記細胞の治療効果の確認 (1)hTERT遺伝子を導入した不死化細胞のラット中大脳動脈閉塞モデルへの移植実験全身麻酔下に中大脳動脈を遮断することで、脳梗塞モデルとした。移植効果の検討は以下のごとく施行し、良好な結果が得られた。 (A)移植幹細胞のホスト虚血脳内での生着・分化を組織学的に検討した結果、ドナー細胞はホスト組織内で良好な生着・増殖・分裂・分化・遊走・組織修復を示すことが判明した。 (B)モーリス水迷路試験で記憶・学習能力・高次機能を解析した結果、移植により著名に症状が改善することが判明した。 (C)トレッドミル運動負荷試験により運動機能の解析した結果、移植により顕著に運動機能が回復することが判明した。 (D)動物実験用高磁場NMR装置1(7テスラー)を用い、同一個体の脳梗塞巣を経時的に画像診断学的に解析した結果、移植による治療効果は画像診断上も著名であることが判明した。 (2)BDNF遺伝子を導入した細胞のラット中大脳動脈閉塞モデルへの移植実験上記脳梗塞へ移植し治療効果を判定したが、良好な結果が得られた。特に、脳梗塞から時間が経過した状態において治療を開始し場合においても良好な結果が得られたことは特記すべきと思われた。 (3)IL-2遺伝子を導入した細胞のラット脳腫瘍モデルヘの移植実験初代培養の骨髄幹細胞でも抗腫瘍効果が見られたが、IL-2遺伝子を導入した細胞では、特に治療効果が高いことが判明した。以上のように、補助金は補助条件に従って、非常に有効に使用された。

脳腫瘍の標的化を目指した細胞・遺伝子治療の開発

基盤研究(B)

研究期間:

2002年

2003年

濱田洋文, 佐々木勝則, 本望修

本研究では、難治性の悪性脳腫瘍に対する効果的な治療法め開発を目的として、A)脳腫瘍を標的化できる新しい変異型ウイルスベクターの開発、ならびに、B)脳神経組織標的性の高い細胞の移入療法の開発を中心に、脳腫瘍の特異的な標的化を目指した細胞・遺伝子治療の基礎研究ならびに実用化研究を行っている。間葉系幹細胞(MSC、mesenchymal stem cell)を用いたラット脳腫瘍モデルの遺伝子治療:ラット大腿骨骨髄から初代培養MSCを調製した。Fischer344ラット脳内に、DsRed標識9Lグリオーマ細胞を移植し、1週間後に遺伝子導入MSCを移植し、経過を追った。MSCは腫瘍全体に拡がり、特に正常脳組織と腫瘍の境界部に多く分布していた。9L脳腫瘍をhIL2遺伝子導入MSCで治療すると、著明な延命効果が得られた。浸潤性の悪性神経膠腫に対する遺伝子治療のベクター細胞としてMSCが有望である。一方、グリオーマでは、Advの受容体CARの発現が低く、従来型のベクターでは遺伝子導入効率が非常に低い。Ad5の受容体CARと結合しないAd40の短いファイバー(F40S)を有するファイバー変異型アデノウイルスをベースとして用い、脳腫瘍選択的な遺伝子導入システムの構築を目指した。ヘパランスルフェートを標的としたK7(lysine7個のストレッチ)モチーフをファイバーに含むF40S-K7変異型ウイルスを用いると、F/wtに比較して悪性神経膠腫に対して数十倍高い遺伝子導入効率が得られた。脳腫瘍に対する選択的標的化の候補分子を探索するために、抗体のFcドメインに結合するProtein AのZ33モチーフをHIループに含むAdv-FZ33アデノウイルスを作成した。今後、このシステムを用いて、脳腫瘍細胞に対して選択的標的化の可能な表面分子と抗体の組み合わせを探索してゆく。

腫瘍の特異的標的化を目指した遺伝子治療法の開発

特定領域研究

研究期間:

2000年

2004年

濱田洋文, 加藤和則, 中村公則, 本望修, 伊藤克礼, 佐々木勝則

腫瘍に対する選択的標的化の候補分子を探索するために、抗体のFcドメインに結合するProtein AのZ33モチーフをAd5ファイバーのHIループに持つAdv-FZ33アデノウイルスを作成した。CARをほとんど発現しないヒト膵癌細胞AsPc1やヒトメラノーマ細胞A375に対する遺伝子導入効率をEGFPないしb-gal遺伝子発現で測定した。AsPc1やA375に発現する表面分子(CD29、CD54など)に対する抗体を付着させたAdv-FZ33による遺伝子導入・遺伝子発現は、コントロール(抗体の非存在下またはコントロールIgG併用でのAdv-FZ33、ならびに野生型Ad5ファイバーAdv-Fwtのウイルス)による遺伝子導入・発現の数十倍に増強できた。また、ErbB2を高発現するヒト卵巣癌細胞(SK-OV3など)への遺伝子導入は、ErbB2抗体の併用により、選択的に著明に(EGFP遺伝子導入細胞%で、5%から90%へ)増強できた。腫瘍細胞とZ33アデノウイルスとを架橋することによって遺伝子導入効率が高まるモノクローナル抗体をスクリーニングすることにより、腫瘍細胞に対して標的化の可能な表面分子と抗体の組み合わせの探索を開始している。先行しているヒト膵癌を標的化できる新規抗体作製のプロジェクトでは、すでに4種類の抗体産生ハイブリドーマが樹立されている。このうちの一つクローンA^*によって得られるモノクローナル抗体は、AdvFZ33アデノウイルスの膵癌細胞AsPc1への遺伝子導入効率を、非常に強く(200倍)増強し、有望である。

遺伝子組み換えヒト神経幹細胞移植による脳梗塞の機能回復

基盤研究(B)

研究期間:

2000年

2001年

本望修, 端和夫, 上出廷治, 本望修

当該研究計画は、ヒト神経幹細胞の移植による脳梗塞後の機能回復の臨床応用を実現化することを目標としたものである。 (1)ヒト神経幹細胞を免疫抑制下の虚血モデル(ラット中大脳動脈閉塞モデル)へ移植し、1-3週後に組織学的解析を行なった結果、虚血巣内および周囲のpenumbra領域にドナー細胞が生着・集積していることを確認した。また、ドナー細胞はホスト組織内で神経細胞、グリア細胞等に分化しており、神経組織の再構築をおこなっていることが判明した。さらに、記憶・学習能力の改善をMorris water maze taskを用いて評価した結果、脳梗塞群で低下が認められた記憶・学習能力は、移植により著明に改善してくることが認められた。また、運動機能の評価をトレッドミルテストで行った結果、脳梗塞群で約50%程度の低下が認められた運動機能は、移植により6週間で約75%程度まで改善していることが判明した。 (2)自家移植へ向け、subventricular/subependymal zoneからの安全な神経幹細胞の採取方法をサルを用いて確立した。成熟脳内に存在する神経幹細胞をドナー細胞とする場合、自家移植療法の可能性が考えられる。ヒトにおいても神経幹細胞は成熟脳内で脳室周囲に存在することが確認されている。同部位は一般にSilent areaとされており、脳組織を採取しても、臨床上、特に問題となる症状の出現は認められない部位である。本研究では、サルを用いて、安全に、神経脱落症状を誘発することなく少量の脳室周囲組織を採取し、神経幹細胞を抽出・培養することが可能であることを実証した。さらに、得られた細胞を脳虚血巣へ移植し、神経回路の再建における効果を確認した。以上のように、補助金は補助条件に従って、非常に有用に使用されている。

ヒト神経幹細胞の移植による中枢神経系疾患の機能回復

奨励研究(A)

研究期間:

1999年

2000年

本望修

当該研究計画はヒト神経幹細胞の成人脳における存在確認、局在、抽出・培養、脳内への移植療法の検討を主題とし、損傷を受けた神経回路の再構築を試みるものであった。成人脳における局在の解析、抽出・培養方法の確立、脱髄疾患・虚血性疾患への移植実験は昨年までの研究ですでに達成されている。本年度は以下の研究結果を得た。 1:ヒト神経幹細胞の外傷モデルへの移植:ヒト神経幹細胞を免疫抑制下の外傷モデル(ラット除皮質モデル)へ移植し、1-3週後に組織学的解析を行なった結果、同部位にヒト神経幹細胞が生着、神経細胞やグリア細胞へと分化し、神経組織を再構築することが確認された。また、ホスト正常脳内へと遊走している所見、および損傷部位より正常脳内へ神経突起を伸ばしている様子も観察された。さらに、損傷部位と正常神経組織との移行部においても瘢痕組織の形成や腫瘍性の増殖は全く示さず、両領域間でスムーズな組織移行が観察された。 2:神経栄養因子で分化を誘導した。神経幹細胞は神経栄養因子を使用しなくてもmitogenの添加を中止するだけで分化を開始し、約半数はneuronになり、また約40%はastrocyteへと分化した。また,ごく少数であるがoligodendrocyteへの分化も認められ、神経系の主要3系細胞に分化することが確認された。一方、神経栄養因子の添加では、さらに選択的な分化を誘導することが可能でった。例えば、PDGFを添加した群では,neuron細胞の比率が多くなり,astrocyteの割合は減少する。同様に、CNTF添加群では、グリア系細胞への分化が促進された。神経幹細胞から分化させた神経細胞の機能解析を電気生理学的に検討すると、分化誘導後、約4週間で活動電位を発するようになり、同時に、神経伝達物質に対する反応性も示した。また、免疫細胞学的解析でも神経伝達物質とその受容体の発現が認められた。さらに、細胞間のシナプス伝達も電気生理学的に確認され、同所見は電子顕微鏡での超微細構造の観察でも確認された。これらの結果より、成人脳由来の神経幹細胞は、移植後、ホストの神経組織内でも機能的に分化し、神経ネットワークを再建でき得ると推測された。 3:Major Histocompatibility Complex(MHC)の移植免疫への影響を検討:神経幹細胞はホスト神経組織へ移植されるとMHC抗原を呈することが判明し、移植療法において拒絶反応を考慮せざるを得ないことが確認された。さらに、MHC class I and class II knock-out由来の神経幹細胞をドナー細胞とした実験でも、同抗原提示が拒絶反応に大きく関与していることが判明した。以上のように、補助金は補助条件に従って、非常に有用に使用されている。

中枢性脱髄疾患に対する遺伝子組み換え細胞の移植による機能回復

基盤研究(C)

研究期間:

1997年

1999年

上出廷治, 本望修

神経移植療法の基礎・臨床研究はパーキンソン病を中心に数多く見られ、その一部は臨床的にも有用性が実証されているが、中枢性脱髄疾患への神経移植治療に関する研究は、世界的にも実験動物レベルの研究が散見する程度である。当該研究計画では,世界に先駆けて、成人臭神経より抽出・培養した olfactory ensheathing cell による髄鞘の再形成に成功した。さらに、成人脳より神経幹細胞の分離・培養clonal expansion (cell-lineの確立) にも成功し、ラット脊髄脱髄モデルへの移植実験により機能的な髄鞘の再構築に成功した。人工的に脱髄をおこさせた哺乳類中枢神経軸索に対して、ヒト成人脳由来の神経幹細胞を移植することで適切な髄鞘再形成を誘導し、神経伝導機能の回復を実現した。髄鞘再形成後の軸索膜上では正常なイオンチャンネルの再配列、軸索周囲におけるイオン環境 (ホメオスターシス) の回復を認め、正常なインパルス伝導を再現できている。これらの研究成果は成人の神経系細胞においても、適切な方法を用いれば再生能力を引き出せることを証明するものであり、中枢性脱髄疾患に対する神経移植療法の開発において非常に有用な結果を得たと思われる。今後は、臨床応用を具体的目標として、よりヒトに近い primate を用いた多角的で体系的な検討が必要と思われる。以上のように、補助金は補助条件に従って、非常に有効に使用されている。

側頭葉てんかんに対する遺伝子療法-海馬へのGABA産生細胞移植-

奨励研究(A)

研究期間:

1997年

1998年

本望修

昨年度は、GABA合成酵素であるglutamic acid decarboxylase(GAD)のhuman cDNA expression vector(pC1-neo-GAD)を作製し、lipofection方法にてhuman astrocyteへ導入後、発現をimmunocytochemistoryで確認した。さらに、それに伴う細胞内GABAの上昇をimmunocytochemistoryで確認した。今年度はGAD mRNAの発現をin situ hybridizationにより確認した。さらに、限界希釈法にて細胞内GABA濃度が十分高められた細胞を選別・clonal expansionし、highly expressed cell lineを確立した。また、組胞内GABA濃度の上昇はHPCLによっても確かめた。われわれは、Nipecotic acid(NPA)にはGABA transporterのreverse operationにより細胞内free-GABAを細胞外に放出させる作用があることを以前より提唱しており、この作用を利用して、細胞内free-GABAレベルを間接的に評価してきた。今回の研究でも上記に得られた細胞に対するwhole-cell voltage clamp in vitro下におけるNPAのmicro-applicationによるGABA current(Cl^- current)の測定により、細胞のGABAの含有量とGABA放出能の測定を行なった結果、human GAD遺伝子導入細胞で著名なGABA currentの上昇を認めた。現在、上記細胞をラット脳内に移植し、in vivoにおけるGABA放出能の測定と抗痙攣作用の検討を行なっている。以上のように、補助金は補助条件に従って非常に有効に使用されている。

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<本望 修>

共同研究・競争的資金等の研究課題 - 本望 修

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