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Research Projects -

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新規がん治療法の開発をめざしたp53との合成致死に関与する遺伝子群の探索

基盤研究(C)

Project Year :

2022.04

2025.03

時野隆至

p53 pathway and its potential targeted therapeutic approach

Grant-in-Aid for Scientific Research (C)

Project Year :

2019.04

2023.03

時野隆至

p53はヒト悪性腫瘍で最も高頻度に変異している遺伝子であるが，「がん抑制遺伝子」であるためp53経路をターゲットとした抗がん剤の開発は遅れている．そのためp53転写ネットワークの全貌を解明することは，がんゲノム情報にもとづいたがん治療に有望な分子標的治療薬の開発につながることが期待できる．本年度は，p53の活性化に関与する長鎖非コードRNA (long non-coding RNA; lncRNA) を探索した．本研究では，TCGA (The Cancer Genome Atlas)のがんゲノムデータを利用して，正常大腸上皮細胞と比較して大腸がん細胞で高発現し，かつ高発現群で予後不良と相関するlncRNAを10個同定した．このうちの1つのlncRNAに注目し，正常型p53遺伝子をもつ大腸がん細胞株HCT116(p53+/+)においてこのlncRNAをノックダウンし，次にRNAシーケンス (RNA-seq) により発現変動遺伝子を網羅的に解析した．その結果，コントロールHCT116(p53+/+)細胞と比較してこのlncRNAノックダウンHCT116(p53+/+)細胞で，p53の代表的標的遺伝子遺伝子CDKN1A（p21タンパク質をコード）の発現が最も有意に上昇していた．そこで，第16番染色体に位置するこの長鎖非コードRNAをlnc53AC（仮称）と名付けた．p53遺伝子をノックアウトしたHCT116(p53-/-)細胞ではCDKN1A遺伝子の発現上昇は見られず，lnc53ACはp53依存的にCDKN1A遺伝子の転写活性化することを確認した．ボルケーノプロット分析とウエスタンブロット解析により，lnc53ACノックダウンはp53遺伝子を翻訳レベルあるいは翻訳後修飾に影響を及ぼしp53を活性化することがわかった．

A better understanding of p53 network for cancer therapy

Grant-in-Aid for Scientific Research (C)

Project Year :

2016.04

2020.03

TOKINO Takashi

p53 is one of the most important tumor suppressor genes. Thus, understanding p53 network is an important issue. In this study, we identified BRMS1L and ARVCF as novel p53-target genes. Functional analysis showed that ectopic expression of BRMS1L inhibited cancer cell invasion and migration; knockdown of BRMS1L by siRNA induced the opposite effects. Importantly, clinical databases revealed that reduced BRMS1L expression correlated with poor prognosis in patients with breast and brain cancer. We found that BRMS1L is one of the mediators downstream of the p53 pathway, such as p21 activation and survivin suppression. We also revealed the knockdown of ARVCF inhibited p53-induced apoptosis. Our results suggest that p53-induced ARVCF indirectly, but not directly, regulates p53 target selectivity through splicing alterations of specific genes. Our study indicates that BRMS1L and ARVCF are involved in tumor suppression, and could be therapeutic targets for human cancer.

先進ゲノム解析研究推進プラットフォーム

新学術領域研究（研究領域提案型）『学術研究支援基盤形成』

Project Year :

2016

2021

小原雄治, 加藤和人, 川嶋実苗, 豊田敦, 鈴木穣, 三井純, 林哲也, 時野隆至, 黒川顕, 中村保一, 野口英樹, 高木利久, 岩崎渉, 森下真一, 浅井潔, 笠原雅弘, 伊藤武彦, 山田拓司, 小椋義俊, 久原哲, 高橋弘喜, 瀬々潤, 榊原康文

①総括支援活動では、応募の機会増加の要望に応えるため今年度から年2回の公募とした。その結果、合計466の応募課題があり、207課題(44%)を採択した。コロナ禍の影響の中、昨年度より応募数は100件近く増加したが、支援内容の精査や支援経費の限度額設定等により、40%超の採択率を維持した。審査委員はすべてプラットフォーム外の専門家とし、評価が同程度の場合は若手、女性、少額科研費からの課題、初めての応募課題を優先した。支援課題は科研費生物系のほぼすべての分野に渡っており、支援の成果を含む論文として2020年度に161報が発表された。この中には「単核貪食細胞系の分化における遺伝子発現制御機構の包括的解明」(Nature Immunol.)、「キンギョの変異体の表現型多様性を作り上げる分子機構の理解」(Current Biol.)、「植物二次代謝経路のゲノム進化に学ぶ生合成デザイン」(Nature Comm.)など広い分野でのレベルの高い成果が含まれている。拡大班会議や情報解析講習会はオンサイト開催が必要なためにコロナ禍の中で見送ったが、WEB開催としたヒトゲノム研究倫理を考える会は5回開催し、各回約500名が参加した。 ②大規模配列解析拠点ネットワーク支援活動においては、最先端技術を支援に提供するとともに、染色体レベルの高精度ゲノム配列決定、シングルセル・空間遺伝子発現解析等の支援技術高度化を進めた。 ③高度情報解析支援ネットワーク活動では、支援から浮かび上がった課題を解決するソフトウェアの開発を進め、実際の課題への適用を進めた。2020年度には、超高速相同性検索ソフトウェアPZLASTの開発、Hi-Cデータを使ったゲノムアセンブリソフトウエア、ロングリードシミュレータPBSIM2の開発などを進め、②と合わせて24報の論文を発表した。

New insights into p53 signaling regulation to cure cancer

Grant-in-Aid for Scientific Research (C)

Project Year :

2013.04

2017.03

TOKINO Takashi

We found that forkhead transcription factor FOXF1 and intercellular adhesion molecule-2 (ICAM2) are novel target genes of p53. The ectopic expression of FOXF1 and ICAM2 inhibited cancer cell invasion and migration, whereas the inactivation of FOXF1 and ICAM2 stimulated cell invasion and migration. Our findings suggest that FOXF1 and ICAM2 induction by p53 are on key pathways in inhibiting cancer cell migration and invasion. We also found CRKL oncogene is downregulated by p53 through miR-200s. First, we identified that miR-200s are direct transcriptional targets of p53 and then miR-200b/200c/429 inhibited CRKL mRNA and protein expression by directly targeting its 3’-UTR region. The CRKL oncogene encodes an adaptor protein containing Src homology 2 and 3 (SH2/SH3) domains and is reported to be overexpressed in a subset of cancer types. Our results demonstrate that the p53 target miR-200b/200c/429 miRNAs are negative regulators of the CRKL oncogene.

バイオインフォマティクスを活用したp53ネットワーク探索と癌治療への応用

新学術領域研究(研究領域提案型)

Project Year :

2013.04

2015.03

時野隆至

p53結合モチーフ認識アルゴリズムを利用して，全ヒトゲノム配列探索により約64万のp53モチーフを同定した。アデノウイルスベクターでp53を発現させた肺がん細胞H1299における次世代シーケンサーを用いたクロマチン免疫沈降解析（ChIP-seq）によるピークと重複するものが20.0%であった。その内約半数は遺伝子間に存在することから，遺伝子介在性非コードRNA (lincRNA) がp53の標的となっている可能性が高いと考えられた。データベースに登録されている約14,000のヒト lincRNA のうち，その上下流10kbにp53モチーフと重複するChIP-seqピークを持つlincRNAを抽出した。qRT-PCRにより発現解析を行ったところ，23個のlincRNAがp53によって転写誘導されることを確認した。さらに機能的解析により，このうち特定のp53標的lincRNAの発現抑制がp53関連アポトーシス誘導を調整したり，特定の遺伝子群の発現を促進したりする結果を得ることができた。この結果は，腫瘍抑制を含めた多様な生理的機能においてp53とlincRNAが複雑な転写ネットワークを形成していることを示唆している。今後はこのようなp53の基礎的研究から新たな診断法やがん治療開発への臨床応用につながる研究をめざしたい。

High-throughput screening for peptides that inhibit the interaction or MDM4 with p53

Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research

Project Year :

2011

2012

TOKINO Takashi, FURUHATA Tomohisa

It is currently of great midical interest to inhibit specific protein-protein interactions between MDM4 and p53. Here, we developed a method using T7 phage display to screen for candidate inhibitors of MDM4-p53 interactions. In primary screening , we identified novel peptide motifs that inhibit the interaction of MDM4 with p53. Then, we designed a number of peptides that are predicted to have higher affinity to MDM4, and identified potential peptides that inhibit the interaction between MDM4 and p53 with higher affinity.

Scientific Support Programs for Cancer Research Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas

Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research in a proposed research area)

Project Year :

2010.04

2016.03

IMAI Kohzoh, INOUE Junichiro, NAKAMURA Takuro, ISHIKAWA Fuyuki, YAMAMURA Kenichi, ARAKI Kimi, YAO Ryouji, TAKANO Hiroshi, TAKAKURA Akira, KATOH Hideki, NAKAGATA Naomi, TOYOKUNI Shinya, WANIBUCHI Hideki, OGAWA Katsuhiro, MITSUMORI Kunitoshi, YAMADA Yasuhiro, SHIBUTANI Makoto, IMAIDA Katsumi, FUTAKUCHI Mitsuru, KANDA Hiroaki, TANAKA Hideo, WAKAI Kenji, MIKAMI Haruo, SUZUKI Sadao, MIURA Katsuyuki, WATANABE Yoshiyuki, ARISAWA Kokichi, TANAKA Keitaro, TAKEZAKI Toshiro, FURUSHO Norihiro, NAITO Mariko, OHNAKA Keizo, KITA Yoshikuni, KURIKI Kiyonori, TAMAKAOSHI Akiko, EGUCHI Hidetaka, KUBO Michiaki, HAMAJIMA Nobuyuki, NAGATA Chisato, HINO Okio, TAHARA Hidetoshi, SUGIMURA Haruhiko, TSUGANE Shoichiro, NAKATOCHI Masahiro, TAKAYAMA Tetsuji, AKAZA Hideyuki, TAKAHASHI Satoru, TSUKAMOTO Taiji, NAITO Seiji, MASUMORI Naoya, YOKOMIZO Akira, NAMIKI Mikio, FUJIMOTO Kiyohide, FUJIOKA Tomoaki, HORIE Shigeo, MORI Mitsuru, MORIWAKI Hisataka, Shimizu Masahito, KANNAGI Mari, ISHIDA Takashi, MATSUOKA Masao, YAMAOKA Shoji, TANAKA Yuetsu, WATANABE Toshiki, YASUI Hiroshi, TSUCHIYA Eiju, DAIGO Yataro, MIYAGI Yohei, TAKAHASHI Takashi, YAMORI Takao, SEIMIYA Hiroyuki, UEHARA Yoshimasa, YOSHIDA Minoru, IMOTO Masaya, FUKAZAWA Hidesuke, KAKEYA Hideaki, DAN Shingo, TOMIDA Akihiro, KAWADA Manabu, OSADA Hiroyuki, MATSUURA Masaaki, MIZUKAMI Tamio, MASHIMA Tetsuo, USHIJIMA Masaru, TOKINO Takashi, SUZUKI Hiromu, SHINOMURA Yasuhisa, NOSHO Katsuhiko, MIYAZONO Kohei, INAZAWA Johji, HIROTA Toru, NODA Tetsuo, SUZUKI Misao, TAKEDA Naoki, YAGINUMA Katsuyuki, SUGITANI Yoshinobu, ITO Hidemi, HOSONO Satoyo, IWASAKI Motoki, NAGASE Hiroki, NISHITA Hiroki, KONO Suminori, HASHIMOTO Syuji, YAMAGUCHI Kazunari, TAKANO Atsushi, TERAMOTO Koji, MATSUDA Koichi, TANAKA Yukichi, AOKI Ichiro, OSAMURA Yoshiyuki, NAKAMURA Naoya, SUZUKI Noboru, TAJIRI Michihiko, KAWASAKI Takashi, YOKOSE Tomoyuki, YANAGISAWA Kiyoshi, HIRAKAWA Akihiro, IIJIMA Yoshihiko, ZEMBUTSU Hitoshi, SASAKI Yasushi, IDOGAWA Masashi, MARUYAMA Reo, KAI Masahiro

We started this project first supporting scientists who aim to overcome cancer, and from 2014 we extended our support to scientists in life sciences. The outcome has been as follows: General Support Group fostered young scientists and those who will be involved in research support in the future, and developed international academic exchanges. Our support services such as providing genetically modified mice and providing bioresources including cancer tissues enabled many scientists to conduct international and cutting-edge researches. All Japan Cohort Group and ATL Study Group (originated in Japan) collected more than 110,000 important samples and contributed for many scientists to produce their results. Chemotherapy Group and Genome and Epigenome Group also achieved more than their original goals. Further, we organized open lectures for general public to inform the importance of scientific support.

Expression analysis of SFRP family genes for development of molecular targeted therapy for oral cancer

Grant-in-Aid for Young Scientists (B)

Project Year :

2009

2010

SOGABE Yohei, OGI Kazuhiso, HIRATSUKA Hiroyoshi, TOKINO Takashi

RNA干渉技術を駆使してアポトーシス誘導シグナルを増強した遺伝子治療法の開発

挑戦的萌芽研究

Project Year :

2009

2010

時野隆至, 古畑智久

癌抑制遺伝子p53の導入による遺伝子治療が有効であると考えられるが、必ずしも著効するとは限らず、さらなる工夫が必要である。これまでに、我々はp21発現抑制miRNA/p53共発現アデノウイルスベクター(Ad-p53/miR-p21)を開発することで癌治療効果を増強することに成功した。そこで、更に別の標的遺伝子のひとつであるMDM2を特異的に発現抑制する人工miRNAの設計を行った。この設計配列を元に4種類のDNAオリゴを合成し発現プラスミドベクターに組み込んだ。このベクターをp53発現ベクターと共に大腸癌細胞HCT116にトランスフェクションしたところ、p53が強発現しているにもかかわらずMDM2の蛋白発現誘導の抑制が認められた。次に、相同組み換えを用いて、このベクターをアデノウイルスベクターAd-miR-MDM2を作成した。このアデノウイルスベクターをAd-p53/miR-p21と共に大腸癌細胞DLD-1に感染させたところ、MDM2の発現抑制によりp53の発現上昇と、それに伴うアポトーシスの増強効果が認められた。肝癌細胞Hep3Bおよび大腸癌細胞SW480にアドリアマイシンを併用した場合においても、miR-MDM2はAd-p53/miR-p21によるアポトーシス誘導を増強した。本研究において、p53発現ベクターにp21抑制miRNAおよびMDM2抑制miRNAベクターを併用することでアポトーシス増強効果を得ることに成功した。miRNA発現ベクターは、他のmiRNAをタンデムに接続することで複数の標的遺伝子の発現を抑制することが可能である。このため、他のアポトーシス阻害的な遺伝子に対するmiRNA設計し、複数を組み合わせることで相乗効果を得ることができる。この研究成果により、更なるp53遺伝子治療効果の増強および治療耐性の回避が期待できる。

Functional analysis of CHFR: Diagnostic and therapeutic application for oral squamous cell cancer

Grant-in-Aid for Scientific Research (B)

Project Year :

2008

2010

TOKINO Takashi, HIRATSUKA Hiroyoshi, OGI Kazuhiro

The mitotic checkpoint gene CHFR is silenced by promoter hypermethylation or mutated in various human cancers, suggesting that CHFR is an important tumor suppressor. Recent studies have reported that CHFR functions as an E3 ubiquitin ligase, resulting in the degradation of these proteins. To better understand how CHFR suppresses cell cycle progression and tumorigenesis, we sought to identify CHFR-interacting proteins using affinity purification combined with mass spectrometry. Herein, we showed poly(ADP-ribose) polymerase-1 (PARP-1), which catalyzes polyADP-ribosylation, to be a novel CHFR interacting protein. In CHFR expressing cells, mitotic stress induced the autoPARylation of PARP-1, resulting in an enhanced interaction between CHFR and PARP-1 and an increase in the polyubiquitination/degradation of PARP-1. The decrease in PARP-1 protein levels promoted cell cycle arrest at antephase, suggesting that the cells expressing CHFR were resistant to microtubule inhibitors. By contrast, in CHFR-silenced cells, polyubiquitination following autoPARylation of PARP-1 was not induced in response to mitotic stress. Thus, PARP-1 protein levels did not decrease, and cells progressed into mitosis under mitotic stress. Furthermore, we found that cells from Chfr knockout mice and CHFR-silenced primary gastric cancer tissues expressed higher levels of PARP-1 protein, strongly supporting our data that the interaction between CHFR and PARP-1 plays an important role in cell cycle regulation and cancer therapeutic strategies. Based on our studies, we demonstrate a significant advantage for use of combinational chemotherapy with PARP inhibitors for cancer cells resistant to microtubule inhibitors.

デジタルゲノムスキャニング法の開発と胃癌関連遺伝子探索への応用

萌芽研究

Project Year :

2007

2008

時野隆至, 古畑智久, 見田裕章, 明石浩史

癌遺伝子の増幅や癌抑制遺伝子の欠失を伴う染色体変化は癌細胞の特徴である.本研究では短いゲノム断片を解析しゲノム上のDNAコピー数以上を示す領域を検出する方法としてデジタルゲノムスキャニング(DGS: Digital Genome Scanning)法を開発し,胃癌細胞株におけるゲノムコピー数異常の検出を試みた. DGS法を利用して,ヒト胃癌細胞株においてKRASCACNAIC (calcium channel, viltage-dependent, 1 type, alpha-1c subunit)を含む2つの約500kbのゲノム領域を染色体12p12.1と12p13.33に同定した.KRAS遺伝子増幅を有する胃癌細胞株では,KRASのmRNAおよびタンパクレベルはKRAS遺伝子コピー数とよく相関していた.正常型KRASが遺伝子増幅した胃癌細胞では,血清刺激後に高レベルのGTP-KRASおよびリン酸化p44/42が検出された.一方,変異型KRASが遺伝子増幅した別の胃癌細胞では,恒常的に高レベルの活性型KRASおよびp44/42が検出された.この結果は,細胞増殖において正常型KRASの遺伝子増幅が無刺激条件下で選択優位性をもたらすのみならず,増殖因子刺激や高栄養環境の条件では点変異KRAS遺伝子と同様に著しい選択優位性を獲得可能なことを強く示唆している. 以上より,DGS法は癌を代表とするゲノムコピー数異常を呈する疾患の原因遺伝子探索において有効な手法となりうることを実証した.

Diagnostic and therapeutic application of cell-cycle checkpoint genes for oral squamous cell cancer.

Grant-in-Aid for Scientific Research (B)

Project Year :

2006

2007

TOKINO Takashi, HIRATSUKA Hiroyoshi, OGI Kazuhiro

CHFR which contains a RING domain and has ubiquitin ligase activity, a novel mitotic checkpoint gene delays chromosome condensation in cells treated with microtubule poisons. CHFR is inactivated by promoter methylation, and cancer cells lacking CHFR are sensitive to microtubule inhibitors. (1) Proteins interacting with CHFR, mitotic-checkpoint ubiquitin ligase. In this study, we isolated cellular proteins capable of interacting with CHFR using yeast two-hybrid method to clarify the function of CHFR. As a result of the screening, we isolated canonical and noncanonical E2 ubiquitin conjugating enzymes as CHFR interacting proteins, which are involved in proteolytic and non-proteolytic ubiquitination respectively. This raises the possibility that CHFR is switching canonical and noncanonical ubiquitination depending on the situation of cells.On the other hand, we isolated gadd34 which interacted with the FHA domain of CHFR. Furthermore, CHFR moved in part from nucleus to cytoplasm in the presence of microtubule inhibitor docetaxel, which enabled colocalization of CHFR and gadd34 in cytoplasm. This colocalization was followed by cell death. These suggest that gadd34 and CHFR cooperate to mediate cell death in response to mitotic stress. (2) CHFR mitotic checkpoint protein inhibits the transcriptional activity of NF-kB. To clarify the molecular mechanisms by which CHFR modulates tumor growth, our analysis focused on transcriptional regulation mediated by CHFR. Using microarray analysis, we found that CHFR downregulated NF-kB signaling. NF-kB-dependent luciferase assay demonstrated that overexpression of CHFR inhibited NF-kB signaling. Moreover, knockdown of CHFR activated the NF-kB activity. Furthermore, we found that IL-8, one of the NF-kB target genes, was regulated by CHFR. mRNA and protein levels of IL-8 were significantly repressed by overexpression of CHFR. Altogether, our findings reveal a novel function of CHFR as a regulator of NF-kB signaling, and which might account for tumor suppression by CHFR.

p53 family : function and cancer therapy

Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas

Project Year :

2005

2009

TOKINO Takashi

Our in silico approach is powerful for identification of p53 target genes and for further understanding the function of p53 in tumorigenesis. We identified that PEDF, FLOT2, and APOD are direct transcriptional targets of the p53 family member genes. We found that significant antitumor effect of adenovirus-mediated p53 family gene transfer on osteosarcoma cell lines in a mouse model. Furthermore, the histone deacetylase inhibitor FK228 was found to enhance adenovirus-mediated p53 family gene therapy in cancer models.

p53遺伝子ファミリーの機能解析とがん治療への応用

Project Year :

2005

2009

時野隆至

p53遺伝子治療とヒストン脱アセチル化酵素阻害剤FK228との併用効果の検討 p53遺伝子治療の奏効率を高めるためには,p53依存性アポトーシス誘導に抵抗性の癌を克服する必要がある。最近,ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤(HDACI:histone deacetylase inhibitor)には細胞周期停止や細胞死誘導効果が報告されており,腫瘍細胞の増殖を抑制する新規の抗がん剤として注目されている。また,白血病などで第2相臨床試験が行われている天然化合物HDACIのFK228(depsipeptide)はCAR(coxsackievirus adenovirus receptor)の発現を増強させることによって,アデノウイルス感染を促進することが報告されている。本研究では,腫瘍細胞の増殖抑制におけるFK228前処理とAd-p53遺伝子導入の相乗効果を,細胞レベルおよびマウスモデルで検討した。その結果,FK228前処理はCARの発現増強を介してAd-p53感染効率を2-5倍増加させることによって,癌細胞のアポトーシス誘導を増強した。また,FK228はp53タンパクのアセチル化も促進し,その結果Noxaの発現誘導を特異的に増加させた。さらに,FK228とAd-p53との併用は,Baxタンパクのミトコンドリアへの移行を促進した。アポトーシス誘導におけるFK228とAd-p53の相乗効果は,siRNAを用いたNoxaとBaxのノックダウンによって顕著に阻害された。ヌードマウスin vivo皮下移植モデルにおいて,p53遺伝子導入単独では増殖抑制の見られなかった癌細胞株においても,FK228との併用によってアポトーシスが誘導され,増殖抑制効果が認められた。本研究により,FK228はp53遺伝子治療との併用薬剤として有望と考えられる。

デジタルゲノムスキャニング法の開発と消化器癌関連遺伝子探索への応用

萌芽研究

Project Year :

2005

2006

時野隆至, 古畑智久

癌遺伝子の増幅や癌抑制遺伝子の欠失を伴う染色体変化はがん細胞の特徴である.本研究では短いゲノム断片を解析しゲノム上のDNAコピー数以上を示す領域を検出する方法としてデジタルゲノムスキャニング(DGS: Digital Genome Scanning)法を開発し,胃癌細胞株におけるゲノムコピー数異常の検出を試みた. 胃癌細胞株ゲノムDNAを制限酵素処理した断片を回収し,連結したクローニングしたDNA断片の塩基配列を決定した.取得した塩基配列をヒトゲノム上にマップし,ゲノム上での断片の分布密度をもとにコピー数異常を示す領域を推定した.DGSで予測されたゲノム増幅領域に存在する癌遺伝子の候補については,次に,Southern blot, FISH, real-time RT-PCR, Western blot法などの分子生物学的手法で検証を行った.このDGS解析により,胃癌細胞株の第12番染色体短腕約0.5Mbのゲノム増幅が同定され,同領域に存在する癌遺伝子K-rasのゲノム増幅を確認した.K-ras領域のゲノム増幅は胃癌細胞株18種中4種で,また臨床胃悪性腫瘍50例中4例で検出された.また,K-rasの遺伝子増幅を示した胃癌細胞株ではMAP kinase(ERK1/2)の恒常的活性化が観察された. 以上より,DGS法はがんを代表とするゲノムコピー数異常を呈する疾患の原因遺伝子探索において有効な手法となりうることを実証した.

p53転写制御因子ファミリーの細胞分化における役割

特定領域研究

Project Year :

2004

2005

佐々木泰史, 時野隆至

p53転写制御因子ファミリー(p53,p73,p63)は多彩な機能を有している.p53が代表的な癌抑制遺伝子であるのに対し,p63は,外胚葉性器官の発生や分化に,またp73は神経系の発生,炎症,アレルギーに関与していることが明らかになっている.我々もこれまでにp63およびp73がNotchシグナルを活性化できること,またp73がIL-4シグナルを介してT細胞の分化に関与していることを明らかにしてきた.本研究ではこれらの知見をさらに押し進め,p53ファミリーがどのような機構で増殖,分化,アポトーシスに関与しているかを明らかにすることを目標とし,以下の成果をあげた. 1)p73,p63に特異的な標的遺伝子としてpigment epithelium derived factor(PEDF)を同定した。PEDF遺伝子のプロモーターにはp73,p63に特異的な応答性配列が認められ,PEDFの発現はp73またはp63によって誘導されたが,p53では誘導されなかった.また,p73を強制発現させたヒト大腸癌細胞株の培養上清を骨由来細胞に添加したところ,細胞の分化を誘導した.この効果はPEDFに対する中和抗体によって阻害されたことより,PEDFがp73,p63の下流で細胞分化に関わっていることが示唆された。 2)p73,p63に特異的な標的遺伝子として細胞膜raftの主要構成分子をコードするflotillin-2を同定した.flotillin-2遺伝子のプロモーターにはp73,p63に特異的な応答性配列が認められた.さらに,p63を強発現させた細胞ではIL-6のシグナル経路が活性化しており,その効果はflotillin-2のsiRNAによって阻害された.以上の結果はp63あるいはp73がflotillin-2の発現調節を介して,細胞分化,炎症に関わっていることを示唆している. 3)ゲノムデータベースからのp53ファミリーに特異的な結合配列を抽出し,その近傍の遺伝子を解析した.その結果vitamin D receptor遺伝子など,p53ファミリーの機能を媒介し直接実行する標的遺伝子を同定した.

Diagnostic and therapeutic application of checkpoint gene CHFR in oral squamous cell cancer.

Grant-in-Aid for Scientific Research (B)

Project Year :

2004

2005

TOKINO Takashi, HIRATSUKA Hiroyoshi, KIDO Sachie

Alterations in the function of cell cycle checkpoints are frequently detected in oral squamous cell carcinomas (OSCCs), and are often associated with the sensitivity of the cancer cells to chemotherapeutic drugs. Recently, a mitotic checkpoint gene, Chfr, was shown to be inactivated by promoter methylation and point mutations in various human tumors. Here we show that the absence of its product, CHFR, is associated with mitotic checkpoint dysfunction, and that cancer cells lacking CHFR are sensitive to microtubule inhibitors. Checkpoint impairment appears to be caused by a prophase defect in this case, as OSCC cells lacking CHFR showed phosphorylation of histone H3 on Ser10 and translocation of cyclin B1 to the nucleus. When CHFR-deficient OSCC cells were treated with a microtubule inhibitor (docetaxel or paclitaxel), significant numbers of apoptotic cells were observed. Moreover, disruption of CHFR using small interfering RNA (siRNA) impaired the mitotic checkpoint, thereby reducing the ability of OSCC cells to arrest at G2/M phase and making them more sensitive to microtubule inhibitors. Our results suggest that CHFR could be a useful molecular target for chemotherapy.

遺伝子あるいは発現プロテオミクス解析を用いた婦人科癌抗癌剤耐性の分子標的の研究

基盤研究(C)

Project Year :

2003

2005

寒河江悟, 寺澤勝彦, 時野隆志, 工藤隆一

寒河江、寺澤らは、Paclitaxel, Docetaxel、新規抗癌剤Oxaliplatinに対してそれぞれ感受性のある細胞株、それらに対する耐性株を用いて、これら細胞株に一定時間、各種抗癌剤を暴露した後、その投与前後における薬剤耐性関連遺伝子群発現のパターンの変化をcDNAアレイなどを用いて検討した。現在、CDDP、Paclitaxel、Docetaxel、254-Sに対するCDDP、Paclitaxel感受性株、耐性株の薬剤投与前後のアレイパターンを解析して、それぞれの薬剤、細胞株に特異的な遺伝子群を検討し、薬剤耐性の機序を解析している。さらに寒河江、寺澤らは、蛋白レベルでの検討のため手術摘出物より極力プロテオリーシスの起きない状況下で蛋白サンプルを採取し、これを電気泳動により展開し、蛋白レベルでの抗癌剤耐性に関与する蛋白の変化をmRNAレベルでの変化と比較検討した。また蛋白質を2-D電気泳動で展開、分離し、2-Dマップを作製、薬剤毎、抗癌剤感受注毎にデータベース化を試みている。今後、こうしたDifferential proteomic displayにより、変化のあったスポットを酵素消化後、質量分析計あるいはシークエンサーにて同定を試みる予定である。これにより、各薬剤毎に薬剤感受性、耐性に関与する蛋白、特にアポトーシス関連蛋白を選定し、同蛋白に対する抗体の作製、及び同抗体の抗癌剤感受性及び耐性に及ぼす影響の実験の基礎としたいと考えている。

卵巣癌におけるエピジェネティクスの異常の解析と治療への応用についての研究

基盤研究(C)

Project Year :

2003

2005

藤井美穂, 寒河江悟, 豊田実, 時野隆至

MCA法による新しい遺伝子の同定:卵巣癌細胞株を用いMCA(methylated CpG island amplification)法により、正常細胞とでサブトラクションを行うことにより、卵巣癌での異常メチル化している多数の遺伝子を同定した。これは卵巣癌に抑制的に働く新たな遺伝子の発見につながるもので、現在遺伝子データベースを利用し各遺伝子について検討している。同時に各遺伝子のエピジェネティクな異常と卵巣癌での分子生物学的特徴について検討中である。 TCF2遺伝子についての解析:上記のMCA法により、メチル化によりサイレンシングしている遺伝子の一つとしてTCF2遺伝子を同定した。TCF2は細胞の分化に関与する転写因子であり、各種腫瘍において発現異常が報告されている。実際卵巣癌ではTCF2遺伝子のメチル化は、卵巣癌細胞株16例中8例(50%)、卵巣癌症例68例中16例(23.5%)に認めた。メチル化を認める細胞株においては、発現の低下あるいは消失を認め、DNAメチル化阻害剤により遺伝子の再発現を認めた。また、プロモーター領域のヒストン脱アセチル化を認め、メチル化による遺伝子発現抑制にヒストン修飾が関与することが示唆された。さらに組織型別では明細胞性腺癌ではメチル化による抑制は少なく高頻度な発現が認められた。これは卵巣癌の中でも予後不良な明細胞性腺癌の生物学的解明につながる可能性がある。(投稿中) 癌での細胞周期M期の制御の解析:これまで細胞周期M期に関わる遺伝子の異常と微小管阻害剤の感受性を検討してきた。ドセタキセルを暴露させたMitotic Indexの高い細胞株は抗癌剤に高い感受性を示し、CyclinBの核への集積が認められた。発現を調節している分子としてBUB1,MAD, Auroraなどの分子について検討中である。さらにCHFR遺伝子を細胞株に導入することによって、M期での分子制御機構の解明や抗癌剤の感受性の変化についても検討中である。

Investigation of causative gene of familial occurrence of idiopathic occlusion of Willis ring

Grant-in-Aid for Scientific Research (B)

Project Year :

2002

2004

HOUKIN Kiyohiro, TOKINO Takashi, TADA Mitsuhiro

Purpose and Background: It is estimated that some genetic factors are closely related to the familial moyamoya disease. Previous microsatellite analysis has suggested that related genes may be located on chromosomes 3,8,12 and 17. However, the responsible gene has not been identified yet. This study aimed to identify the responsible genes that are located in the 17825 locus. In addition, clinical anticipation and the presence of triplet repeat was investigated and the basic FGF and HGF of the cerebrospinal fluid of moyamoya patients were measured. Methods and Results: Considering the function, we selected nine genes as candidates from a total of 65 genes identified in the 9-cM region of D17S785-D17S836 in chromosome 17825, and performed sequence analysis on the DNA samples obtained from a pedigree of familial moyamoya disease, which showed a complete linkage to the region by a haplotype analysis. Also, we attempted to identify candidate genes that have not been known but might be functionally relevant to the disease among a total of 2,100 expressed sequence tag (EST) sequences using bioinformatics techniques. As results, the sequence analysis could detect no mutation in the nine genes. Nor could we identify a novel candidate gene by the EST analysis. Clinical anticipation study was done based on 141 cases with moyamoya disease. This analysis revealed that apparent clinical anticipation was observed in familial moyamoya disease. No triplet repeat was found in 17g25 locus. Cerebrospinal fluid was obtained from the patients during surgery. Control value was measured using asymptomatic cerebral aneurysm patients and other ischemic cerebrovascular disease. As results, high value of basic FGF and HGF was seen in the cerebrospinal fluid of moyamoya patients compared to the control group. Conclusions: Clinical anticipation observed in familial moyamoya patients suggests that some triplet repeat may located in some gene in moyamoya disease. Further studies using alternative approaches are warranted to clarify the pathogenesis of moyamoya disease. However, our results of high level of some cytokines including basicFGF and HGF suggests that some gene abnormality related to these cytokines are closely involved the pathogenesis of moyamoya disease.

転写制御因子p63の発生,分化における役割

特定領域研究

Project Year :

2002

2003

佐々木泰史, 時野隆至

1.正常の発生段階あるいは細胞分化においてp53ファミリーメンバーの機能を媒介し直接実行する標的遺伝子を決定するために,p53ファミリーをいくつかのヒト癌細胞株に導入し、cDNA microarrayによる発現解析を行った.その結果,p73の特異的標的遺伝子としてIL-4Rα遺伝子を同定した.さらにIL-4Rαゲノムにp73タンパクと細胞内で特異的に結合する部位を同定し,p73がこの配列に結合することによりコファクターがリクルートされ,ヒストンのアセチル化が促進されることを明らかにした.またp73が活性化した細胞をIL-4で刺激すると,STAT6の活性化とアポトーシスが誘導され,この効果はIL-4Rの中和抗体により抑制された.この結果はp73がIL-4シグナルを介して細胞の分化,炎症,アレルギーに関わっていることを示唆している. 2.p53ファミリー共通の標的遺伝子としてosteopontin(OPN)を同定した.OPNは主に活性化T細胞から分泌されるサイトカインで,骨組織の形成に不可欠だけでなく,B細胞の分化増殖や抗体産生能に重要な役割を果たしていることが示された.この結果はp53ファミリーの機能に関する新しい知見と考えられる. 3.p53ファミリーにおいて最も最も高親和性で結合するDNA配列には違いがあり,スペイサーが介在するp53結合モチーフ配列RRRCWWGYYYの3コピー以上で構成される配列が,p63あるいはp73の高親和性応答配列として働くことが示唆された.従ってp53ファミリーは結合配列に対する親和性の違いにより標的遺伝子の使い分けをしており,生体においては単純に機能が重複している遺伝子ファミリーではないことを明らかにした.

Function of p53 and its target genes

Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas

Project Year :

2000

2004

TOKINO Takashi

1. Novel p53-target genes : Tumor suppressor p53 is a transcription factor that induces growth arrest and/or apoptosis in response to cellular stress. To identify novel p53-inducible genes, we compared the expression of genes in normal mouse embryo fibroblasts to p53-null cells by cDNA representational difference analysis (RDA). We have identified that expression of endogenous SCN3B (sodium channel subunit beta 3) and OPN (osteopontin) are upregulated in mouse embryonic fibroblasts by DNA damage in a p53-dependent manner. The p53-directed regulation of OPN expression suggests a novel model of p53 participation in immunosurveillance, involving interaction with the host immune system to prevent damaged cells from undergoing malignant transformation. The results presented above also suggest that SCN3B mediates a p53-dependent apoptotic pathway and may be a candidate for gene therapy combined with anticancer drugs. 2. Biological functions of the p53 family member genes : p63 and p73 were recently identified as members of the p53 gene family. In contrast to p53 however, p63 and p73 are rarely mutated in human cancers. To determine how p63 and p73 are involved in carcinogenesis and normal development, we attempted to identify target genes that are specifically regulated by p63 and/or p73 but not p53. We identified the JAG1 and JAG2 genes, encoding ligands for the Notch receptors, and the PEDF gene are direct target of p63 and p73. We also found that IL4 receptor alpha is upregulated by p73. These findings show an association between the p53 family genes and Notch signaling and suggest a potential molecular mechanism for the involvement of the p53 family genes in normal development. Our data also suggest that IL-4Ralpha could mediate, in part, certain immune responses and p73-dependent cell death. 3. Adenovirus-mediated transfer of the p53 family genes, p73 and p63 induces cell cycle arrest and apoptosis in human cancer cell lines : p53 gene therapy is being tested clinically for the treatment of human cancer, however, some cancer models (in vivo and in vitro) are resistant to p53. To explore the potential use of two p53 homologues, p73 and p63, in cancer gene therapy, we introduced p53, p73 and p63 into colorectal cancer cell lines via adenoviral vectors, and compared their effects on cell growth. Among 10 cell lines tested, six cell lines displayed a similar response following transduction of p53, p73beta or p63gamma ; two lines underwent cell-cycle arrest, three lines exhibited apoptosis and one line showed no-effect following transduction. The effect on cell-cycle progression was variable in the other four cell lines. Interestingly, three cell lines were resistant to p53-mediated apoptosis, including two lines having endogenous wild-type p53 alleles, but underwent apoptosis after transduction of p73beta or p63gamma. Transduction of p73beta and p63gamma also reduced the tumorigenicity of two colorectal cancer cells in vivo. These results suggest that adenovirus-mediated p73beta and p63gamma transfer are potential novel approaches for the treatment of human cancers, particularly for tumors that are resistant to p53 gene therapy.

Genetic analyses for DNA replication error, beta-catenin gene, SKT11 etc.among the patients with gynecologic cancer

Grant-in-Aid for Scientific Research (C)

Project Year :

1999

2001

SAGAE Satoru, KUDO Ryuichi, TOKINO Takashi, ISHIOKA Shinichi

The recent studies showed that the RER abnormalities were detected in 23 % for endometrial cancer and 3 % of ovarian cancer, which genetic changes were detected in only endometrioid type of cancer. The prognosis of RER positive patients (pts) with endometrial caner tended to be worse and among them a case with MMR gene mutation (hMLH1 etc) was detected. The mutation of beta-catenin gene were detected in 5 cases (8 %) of 61 ovarian cancer pts and 5 cases (14 %) of 35 endometrial cancer pts, and a micro metastasis of pelvic lymph node had a mutaton of beta-catenin gene,which might be useful for molecular diagnosis of lymph node metastasis. The putative SKT11 gene, which function is Serine/Threonine Kinase, was reported as causative gene of Peutz-Jegher Syndrome. We performed the mutational analysis of STK11 gene in 30 ovarian cancer pts by SSCP-Sequence method. Only one case showed its mutation of CCG-CTG(Pro281-Leu)at exon 6 and two cases showed extra bands at exon 5. A new anticancer drug group, Taxanes (Paclitaxel or Decetaxel) has been introduced for the treatment of ovarian cancer. However, chemosensitivities of these drugs are not determined before treatment of ovarian cancer. We tried to find out the possibilities of early detection of chemosensitivity by using genetic alteration, such as p53, BAX, Bcl-2 etc, and to analyze the mechanism of drug resistance. We showed that Paclitaxel-induced apoptosis played important roles of two different signal transductions, such as p53 independent pathway and stress-induced pathway in ovarian cancer cell lines, Blocking of these pathways and overexpression of bag-1 or hsp70 might be essential for the acquired resistance for Paclitaxel.

ヨーロッパなどががん研究先進国との研究交流

特定領域研究(A)

Project Year :

1999

黒木登志夫, 石川冬木, 樋野興夫, 菊池章, 開祐司, 宮園浩平, 佐谷秀行, 貝淵弘三, 山本雅, 時野隆至, 秋山徹, 高橋雅英, 田中信之, 武藤誠, 堀井明

1.研究背景: がん遺伝子の発見をきっかけに、がん研究は遺伝子の時代に入り、欧米のがん研究先進国を中心に激しい研究競争を繰り広げている。地理的に隔離されているわが国の研究者は、研究者との直接の討論、情報、資料交換に自ら制限があり、ともすると孤立しかねない。この問題点を克服するため、わが国の第一線の研究者を積極的にがん研究先進国に送る必要がある。本研究は、ヨーロッパのがん研究先進諸国との研究交流を目的に組織された。特に、日独、日仏がんワークショップはそれぞれ一年毎にヨーロッパ本国と日本と場所をかえて行われているが、本年度は日独をヨーロッパで、日仏を日本で開催した。本年度は10名をヨーロッパ諸国に派遣した。 2.日独がん研究連絡会議: 1999年7月29〜31日独国・エッセン、エッセン大学において「分子細胞生物学的がん研究」に関する日独がんワークショップを開催した。わが国から黒木登志夫(昭和大・腫瘍分子研)、秋山徹(東大・分生研)、菊池章(広島大・医)、樋野興夫(癌研)、石川冬木(東工大・生命理工学)が本研究費で出席した。 3.日仏がん研究連絡会議: 1999年9月8〜10日、東北大学・医学部において、「21世紀のがん研究に向けての新しい戦略」をテーマに日仏ワークショップが開催された。フランス側から12名、わが国からは黒木登志夫(昭和大・腫瘍分子研)、石川冬木(東工大・生命理工学)、宮園浩平(癌研)、広橋説御、塚田俊彦、落合孝広(国立がんセ・研)、渋谷正史、中村祐輔(東大・医科研)、中山敬一(九大・生医研)、月田承一郎、武田俊一(京大・医)、伊藤嘉明(京大・ウイルス研)、菅野晴夫(癌研)、豊島久真男(住友病院)が本研究費で出席した。 4.その他の派遣者: 宮園浩平(癌研)、藤井穂高(東大・医)、丸義朗(東大・医科研)、開祐司(京大・再生医研)、千葉英樹(札幌医大・医)をヨーロッパの先進研究室に派遣した。

罹患同胞対法を用いた胃がん関連遺伝子の解明

特定領域研究(A)

Project Year :

1999

笹月健彦, 松野正紀, 横田淳, 伊東文生, 磨伊正義, 三輪晃一, 時野隆至

胃がんの発症に寄与するがん関連遺伝子の単離を目的として、胃がん罹患同胞対検体収集、若年発症弧発胃がん症例検体の収集を継続し、罹患同胞対法による全ゲノムスキャニングを行った。 1.17施設の臨床グループにより、胃がん同胞発症対から、インフォームド・コンセントに基づいて採血を行い、DNAの抽出・保存を行った。これまでに70組の同胞対検体が収集された。 2.上記の胃がん同胞発症対57組に対して、4施設の解析グループにより400個のマイクロサテライトマーカーを用いたDNA多型解析を行った。MAPMAKER/SIBのプログラムを用いた連鎖解析を、全染色体について終了した。第1、8、9、11、21染色体において1.0以上のLOD値を示す領域を見出した。 3.健常対対照群326人のDNAを利用して、日本人集団における各マーカーのアリル同定の作業を4施設の解析グループにより完了した。 4.若年胃がん発症例(弧発例)の末梢血の採取を開始し、これまでに100人(発症時平均年齢41.6歳)のDNAが抽出・保存された。これまでの57組を対象とした解析において、1以上のLOD値を示す上記染色体が同定されたことは注目に値する。解析数を増やすこと、若年発症弧発例を用いて解析すること等により胃がん発症との関連を確認する。

Functional analysis of p53-target genes.

Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)

Project Year :

1999

TOKINO Takashi

We isolated p53-binding sites by genetic approach in yeast and then identified novel p53-target genes. One of these, called BAl1 , which was expressed in brain and repressed in 8/9 glioblastomas, was further characterized to inhibit neovascularization in the rat cornea by basic FGF.To investigate the in vivo anti-angiogenic effect of BAl1 gene on a human glioblastoma cell line, p53-defective human glioblastoma cells U373MG were transduced with the BAl1 gene using a recombinant adenoviral vector. In vivo neovascularization assay of the BAl1-infected glioblastoma cells was then performed using skinfold chamber system transplanted in SCID mice and revealed that BAl1 transduction resulted in reduced neovascurization in SCID mice. Expression of the glycosyl-phosphatidylinositol-anchored molecule-like protein (GML) gene, another p53 target, correlates with the sensitivity of some cancer cell lines to anticancer drugs and ionizing radiation. To investigate the function of GML further, we introduced the GML cDNA into various cancer cell lines under control of the tetracycline-regulated system. When we introduced GML into human glioblastoma cell line T98G, which lacks wild-type p53 and expresses no endogenous GML, we observed significant growth suppression accompanied by G2/M arrest in two independent, stable cell lines. We confirmed introduction of apoptosis by fluorescence-activated cell sorting (FACS) analysis and nuclear staining. Our results indicated that GML could induce apoptosis of T98G without functional p53, and implied that GML plays a crucial role in the apoptosis pathway in some cancer cells.

BAI1 expression in human glioma

Grant-in-Aid for Scientific Research (B)

Project Year :

1998

1999

ARITA Norio, NAKANO Atsuhisa, MATSUMOTO Tsuyoshi, KABA Keizo, TOKINO Takashi

BAI1, brain angiogenesis inhibitor 1, was originally isolated as a p53-target gene. BAI1 gene has a p53-binding sequence, and it was directly induced by wild-type p53. BAI1 protein has thrombospondin type 1 repeats which inhibit angiogenesis. In human gliomas, p53 mutation has been frequently observed. It might be possible that in gliomas with mutant p53, BAI1 expression reduced resulting in increased angiogenesis and enhanced tumor growth. We examined relationship between BAI1 expression, p53 mutation and aniogenesis using human glioma tissues. 〔Materials and methods〕 Using human glioma tissues obtained by surgery, (1) expression of the BAI1 gene, (2) mutation of the p53 gene, (3) correlation between BAI1 expression and p53 mutation, and (4) correlation between BAI1 expression and angiogenesis were studied. 〔Results〕 (1) BAI1 mRNA was semiquantitatively assayed by RT-PCR. Compared with that of normal brain tissue, it was reduced in 70% of the glioma examined. BAI1 expression was more frequently reduced in high grade gliomas. (2) Mutation of the p53 gene was analyzed by PCR-SSCP. P53 gene was mutated in 30% of the glioma. These mutation occurred in the locus affecting the transcription regulating capacity of the p53 gene. (3)No significant correlation was found between BAI1 expression and p53 mutation. (4) Glioma tissues were immunostained by an anti -CD34 antibody to examine the density of the tumor vessel. In the glioma in which BAI1 expression was reduced, number of the tumor vessels was increased as compared that of the glioma with normal BAI1 expression. 〔Discussion〕 These results indicate that in some glioma, BAI1 expression might be reduced by other factors than p53 mution. BAI1 protein overproduction by BAI1 gene transfer may inhibit angiogenesis in glioma with reduced BAI1 expression. In T98G and U87MG glioma cell lines, BAI1 gene is now tried to be transferred using Tet-On system to investigate how inhibition of the angiogenesis may influence on the glioma cell growth in vivo.

Positional cloning of carnitine trasporter gene and its comtribution to the pathophysiological changes

Grant-in-Aid for Scientific Research (B)

Project Year :

1996

1997

KUWAJIMA Masamichi, TOKINO Takashi, MURAKAMI Takashi, NOMA Yoshihiko

The exact roles playd by carnitine in vivo have remained unclear. Our recent discovery of mice with systemic carnitine dificiency (JVS mice) offers the possibility of improvement of this circumstance. These JVS mice show symptoms such as fatty liver, hyperammonemia, hypoglycemia, cardiomegaly and skeletal muscle degeneration. We have been analyzin the histological, biochemical and molecular biological features of tissues from various sites of their bodies, focusing on the analysis of the relationship between carnitine deficiency and the diverse symptoms exhibited by these mice. We have obtained the following findings : 1. As early as 2 weeks of age, JVS mice had higher absolute heart weights and higher retios of heart weight to body weight than controle mice. Hypertrophy of my ocardial cells was seen, and the nuclei of these cells tended to be larger in JVS mice. When observed under an electron microscope, the nuclei were slightly hypertrophic and not a few cells showed marked increase in mitochondria. The levels of carnitine palmitoyl transferase I (CPTI) mRNA and CPT II mRNA differted from those in controle mice. 2. High-affinity carnitine transport activity was absent in the fibroblasts of JVS mice. This indicates that JVS mice can serve as an animal model of human primary carnitine dificiency. 3. The symptoms seen in JVS mice are genetically transmitted in an autosomal recessive manner. It is thougt that a single gene is responsible for all these symptoms. The JVS gene was located on chromosome 11.

癌抑制遺伝子の単離とそのヒト癌における遺伝子異常の解明

重点領域研究

Project Year :

1995

時野隆至, 中村祐輔, 江見充, 藤原義之

32人の食道癌患者の種々の段階の106病変(異形成・早期癌・進行癌)における遺伝子異常を、マイクロサテライトマーカーを利用した染色体欠失を指標として解析し、3p,17pの癌抑制遺伝子の不活性化が異形成の段階ですでに起こっていることや9p,9qの癌抑制遺伝子の不活性化は癌化の段階で重要な役割をしていることなど、食道癌においても多段階的に遺伝子異常が蓄積されていることを明らかにした。また、種々の臓器の扁平上皮癌の発生に共通して関与していると考えられる第9染色体長腕の遺伝子については、数百kbの範囲まで癌抑制遺伝子の存在部位を限局化することができた。遺伝性癌の原因遺伝子のひとつであるMLH1遺伝子の変異を効率よく検索し発症前診断に応用するために、この遺伝子の全エキソンを1枚のゲルで解析するスクリーニング法を確立した。この方法によって全エキソンの変異の有無の検索を24時間以内に行うことが可能となった。さらに、リンパ節転移の有無を原発巣において認められる遺伝子異常を指標として遺伝子レベルで診断することの臨床的意義を調べるため、120例の病理組織学的にリンパ節転移陰性と診断された大腸癌患者についてレトロスペクティブに検討を行った。その結果、遺伝子診断はより正確な予後判定指標であり、術後の化学療法の適否を判断するための有用な指標になりうることが示唆された。また、抗p53抗体による免疫組織学的な検討の結果と遺伝子診断の結果との対比から、MASA法による解析によって生きた癌細胞のみならず、免疫細胞に呑食された癌細胞をも検出可能であることが示唆された。次に、p53蛋白の結合すると考えられるDNA断片を有するコスミドクローンを単離し、それらをもとに正常p53蛋白によって発現が誘導される2種類の新規の遺伝子の単離に成功した。

がんの遺伝子診断

重点領域研究

Project Year :

1994

1996

珠玖洋, 安井弥, 高橋隆, 森下和廣, 時野隆至, 金子安比古, 谷口直之

1.胃癌組織40例において、CDC25Aは45%、CDC25Bは70%(28症例)において発現増強が認められ、CDC25Cは全てで低発現だった。CDC25Bは低分化腺癌症例、ステージの進んだ症例に発現増強が認められた。又、分子病理診断の一つとしてCAr ep eatを2ローカス、polyAを2ローカス検討し、約5%の症例でreplication errorを同定した。分子病理診断は9000例にいたった。 2.208症例の非小細胞癌症例でcyclinD1およびRb遺伝子の検討を行ったところ、cyclinD1遺伝子発現の消失がみられた腺癌症例は、有意に短い術後生存期間を示した。多変量解析でもcyclinD1はp53、病期と共に独立した有意な予後因子だった。 3.神経芽腫106例を対象として、1p36のD1Z1と1q12のD1Z1プローブを用いてFISH法で検討した。D1Z1の数(n数)、およびD1Z1数に比してのD1Z2数(D1Z1>D1Z2;b;D1Z1=D1Z2;a)更に、RFLPマーカーによる1pのLCH、及びN-myc増幅を合わせて検討した。その結果、2nb、4nb腫瘍は予後不良、3n、5n腫瘍は予後良好、2na、4na腫瘍はその中間であった。 4.急性骨髄性白血病における第三染色体の異常をEVI1遺伝子を中心として解析した。t(3;7)転座を有する症例、t(1;3)転座を有する症例の切断点および遺伝子を同定した。又40症例の白血病においてガングリオシドGM3からのGD3の合成酵素、α2,8シアル酸糖転移酵素の発現を検討したところ、T-ALLで中等度の、ATLで高い遺伝子発現が認められた。 5.p53の下流標的遺伝子の検索を進め、8種類の正常型p53により発現制御される遺伝子を同定した。そのひとつはGPl anchor ed mol eculeに属する新しい遺伝子であり、その発現は食道癌細胞株の抗癌剤感受性と強い相関性を示した。 6.AFPやγ-GTPの糖鎖に癌性変化を起こすα1,6 fucosyltr ansfer aseの精製を行いそのcDNAを単離した。

癌抑制遺伝子解析のためのヒト第3染色体遺伝的地図の作成および遺伝子の同定

一般研究(A)

Project Year :

1990

1991

中村祐輔, 土屋永寿, 北川知行, 時野隆至, 佐藤孝明

癌における癌抑制遺伝子の異常は一般的に一方の染色体側の欠失と他方の染色体側の小さな変異(点変異や小さいDNA断片の挿入・欠失)として認められる。したがって、対象とする腫瘍組織において欠失している染色体部位を詳細に検討することにより、その腫瘍の発生に関与する癌抑制遺伝子の存在する位置を同定することが可能である。われわれは肺の非小細胞癌の発生に関わる癌抑制遺伝子を単離することを目的として49例の腺癌・18例の扁平上皮癌におけるヒト第3染色体短腕領域の欠失について、19のRFLPマ-カ-を利用して調べた。この結果、49例の腺癌のうち33例(67%)がこの染色体の欠失を起こしていたことが明かとなった。また、比較的多くの症例がこの染色体の一部分だけを欠失していることがわかった。さらに複数の腫瘍に共通して欠失している領域は3p21.3と3p14.1ー21.1の2領域であることが同定され、第3染色体上には肺の腺癌の発生に関与する癌抑制遺伝子は少なくとも2個存在すると推測される。さらに、染色体欠失の頻度とステ-ジを比較したところ、ステ-ジ1・2では30例中17例が欠失していた(57%)のに対し、ステ-ジ3では19例中16例(84%)の高頻度の欠失を認めた。また、病理学的分化度との対比では高分分子化癌では22例中12例(55%)の欠失頻度であったのに対し、未分化癌では7例中7例とも欠失していた。このことから、第3染色体上の癌抑制遺伝子の異常は肺腺癌の増悪因子としてとらえられるのではと考察される。また、扁平上皮癌では18例すべてにおいて、第3染色体短腕の欠失を認め、欠失領域も腺癌と比べて大きな領域であった。したがって、どの染色体の部位に問題となる遺伝子が存在するかを特定することはできなかった。今後は、さらに用いるRFLPマ-カ-の数を増やして、多数のサンプルを調べ、遺伝子の単離を目指したい。

DNA増幅法(PCR法)による高多型VNTRマ-カ-の単離

一般研究(C)

Project Year :

1990

1991

時野隆至

最近、多用されているミクロサテライトDNAの多型を効率よく同定する方法をテストした。ヒトゲノムコスミドライブラリ-に対してオリゴヌクレオチドCACACACACACACACACACAを用いてスクリ-ニングしたところ、約40%のクロ-ンが陽性であった。ミクロサテライト多型はくり返し配列の両側の配列を決定し、この配列からプライマ-を設計してPCR法(Polymerase Chain Reaction法)によりヒトゲノムDNAを増幅し、アクリルアミドゲル電気泳動によって長さに従ってDNAを分離することによって同定される。この際、最も労費を要するのはくり返し配列両側のDNAの配列を決定することである。そこでこのステップを簡便化するためにCAを10回くり返したオリゴヌクレオチドの3'側にA,GあるいはTを加えたもの、CC、CT、もしくはCGを加えたものの6種類のプライマ-をミックスしたものを直接コスミドのDNA配列を決定するプライマ-として用いた。この結果、約30%のクロ-ンがこれで直接配列を決定することが可能であった。3種類ずつにしたものでは約70%のクロ-ンがシ-クエンス可能であった。今後、この方法を利用してCAのくり返しによる多型を同定していくことが可能であると考える。

乳癌・大腸癌における癌抑制遺伝子の単離

がん特別研究

Project Year :

1990

中村祐輔, 三木義男, 西庄勇, 時野隆至, 佐藤孝明

乳癌に関しては200例の乳癌患者の正常および癌組織よりDNAを抽出し、RFLPマ-カ-による染色体の欠失を調べた。全染色体にわたる40個のRFLPマ-カ-によって検索した結果、第3染色体(45%)、第13染色体長腕(28%)、第16染色体長腕(46%)、第17染色体短腕(57%)、第17染色体長腕(38%)に高頻度の欠失を認めたことから、これらの部位に癌抑制遺伝子の存在することが示唆された。また、erbB2遺伝子領域の増幅と第17染色体短腕の欠失との間強い相関(p<0.001)が認められたことから染色体の異常は独立しておこるのではなく、ひとつの異常が他の異常を起こし易くする可能性が考えられた。また、第13染色体の欠失も第17染色体の欠失が影響している可能性が示されるとともに、この染色体上の癌抑制遺伝子の欠失が、癌の増悪に関係することが病理学的な診断との比較により示唆された。また、それぞれの染色体における共通欠失領域の同定も行い、第3・16・17染色体については5〜10cMの領域に癌抑制遺伝子の存在部位を限定している。大腸癌については、第5染色体の家族性大腸腺腫症の原因遺伝子の検索を中心に研究を行った。一人の患者からの複数個の腺腫と癌における染色体欠失を調べたところすべての腫瘍が同一領域を欠失していたことから染色体欠失はランダムに起きるのではなく特別なメカニズムによって起こっていることが示唆された。さらに、家族性大腸腺腫症患者において同定した200kbの欠失領域近傍より単離した3種類のcDNAのひとつが大腸癌において欠損あるいはアミノ酸置換をおこす点変異を起こしていることが明かとなった。この遺伝子はG蛋白活性化ドメインと考えられる領域を有し、大腸癌の発生に関与する癌抑制遺伝子であり、MCC(Mutated in colorectal carcinoma)遺伝子と名付けた。

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<TOKINO Takashi>

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