研究者詳細 - 横田　伸一

共同研究・競争的資金等の研究課題 - 横田　伸一

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Apilactobacillus kosoi 10HT 乳酸菌株由来新奇リポテイコ酸の構造および免疫賦活活性の構造活性相関の解明

研究期間:

2023年04月

2025年03月

横田伸一, 白石宗

低活性を示すToll様受容体アゴニストの情報伝達経路の解明

基盤研究(B)

研究期間:

2020年04月

2023年03月

横田伸一, 小笠原徳子, 山本聡, 白石宗, 永島裕之, 佐藤豊孝

グラム陽性菌リポテイコ酸（LTA）のIL-8産生誘導能に関して、ヒト結腸癌由来細胞であるCaco-2細胞は、TLR4アゴニストのリポ多糖（LPS）、TLR2/TLR1アゴニストのPam3CSKや３種の乳酸菌LTAにはほとんど応答しないのに対して、黄色ブドウ菌LTAとTLR2/TLR6アゴニストでのみIL-8産生が認められるという特異なサイトカイン応答を示した。検討した3種の乳酸菌LTAと黄色ブドウ球菌LTAの親水性領域はD-アラニン置換のあるグリセロールリン酸ポリマーで共通している。一方、アンカー糖脂質の脂質成分として、黄色ブドウ球菌ではC18:0と分岐脂肪酸であるanteiso-C17:0、anteiso-C15:0から構成され、乳酸菌では不飽和脂肪酸C18:1(n-9)とC16:0、さらにガセリ菌以外ではシクロプロパン環を有するC19:cyが含まれていた。脂質の組成の違いがLTAのCaco-2細胞によるLTAの認識に違いを与えていることが示唆された。低活性TLRアゴニストの情報伝達とマクロライド系抗菌薬が持つ免疫調節活性の情報伝達系の関連性に関して、クラリスロマイシン結合タンパク質として同定していたNIP-SNAP-1, 2のCrispr-Cas9によるノックアウト（KO）細胞株とsiRNAによるノックダウン（KD）細胞株を作製した。グラム陰性菌リポ多糖（LPS）刺激によるIL-8, IL-6産生誘導は、KDで著明に低下したが、KOでは変化が認められなく、挙動に違いが認められた。NIP-SNAP-1, 2のサイトカイン誘導との関連は示唆されたが、KOにおける挙動では何らかのサルベージ経路が働いているとの仮説を立て、RNseq解析を行い、それに関わる因子の同定に着手した

遊離脂肪酸の病原細菌への効果の解明と熱傷局所療法への応用の研究

基盤研究(C)

研究期間:

2017年04月

2023年03月

上村修二, 横田伸一, 文屋尚史, 白石宗

黄色ブドウ球菌3株(標準株、市中感染型MRSA、病院感染型MRSA)に対する以下の8種類の脂肪酸：C14:1(cis-9)、C16:0、C16:1(cis-9)、C16:1(trans-9)、C18:0、C18:1(cis-9)、C18:2(cis-9、12)、C20:1(cis-11)のMICを測定した。脂肪酸単独による検証ではC14:1(cis-9)、C16:1(cis-9)で抗菌活性を認めた。Gentamicin併用ではC14:1(cis-9)、C16:1(cis-9)、C16:1(trans-9)、C18:2(cis-9,12)で増強作用を認めた。Fradiomycin併用ではC14:1(cis-9)、C16:1(cis-9)、C16:1(trans-9)、C18:2(cis-9,12)で増強作用を認めた。Sulfadiazine silver併用では増強作用を認めた脂肪酸はなかった。本研究でC14:1(cis-9)、C16:1(cis-9)は単独での抗菌活性に加えて、アミノグリコシド系への増強効果も期待できることがわかった。GentamicinとFradiomycinは通常臨床で使用している軟膏に含有されている抗生剤であるため、適切な脂肪酸を加えることで更に抗菌作用を強められる可能性が示唆された。現在、熱傷創で黄色ブドウ球菌と並んで問題となっている緑膿菌に対しても抗菌活性や抗生剤の増強効果を検証中である。

RSウィルス下気道炎発症予測のための疾患特異的microRNAの有用性の検討

若手研究(B)

研究期間:

2016年04月

2018年03月

山本圭佑, 氷見徹夫, 横田伸一, 高野賢一, 黒瀬誠, 亀倉隆太, 大國毅, 小笠原徳子, 山本聡

RSV感染症に対する治療として①クラリスロマイシン（CAM）、病状評価として②疾患特異的microRNAに着目した。CAMはRSV誘導性type I, III IFNsの産生を抑制した。転写因子活性を検討したところIFN-β,IRF-3制御下の転写因子活性がCAM処置により抑制された。さらに免疫染色を用いてIRF-3の細胞内局在を検討した結果，CAMはRSV誘導性IRF-3の核移行を抑制することで、RSV誘導性type I, III IFNsの産生を抑制していた。RSV感染特異的に発現上昇する分泌型miRNAを同定した。鼻汁の分泌型miRNAのhousekeeping geneを同定した。

ムコイド型肺炎球菌の薬剤抵抗性の解明

基盤研究(C)

研究期間:

2015年04月

2018年03月

宮本篤, 横田伸一, 白石宗, 北川学

北海道全域から集められた肺炎球菌1,061株からムコイド株51株が得られた。バイオフィルム形成能、各種抗菌薬の最小バイオフィルム抑制濃度、増殖速度等を評価したが、ムコイド株、非ムコイド株で顕著な差は認められなかった。評価の過程で、納豆由来ペプチドが肺炎球菌とBacillus 属の Bacillus subtilis groupに特異的に殺菌作用を示すことを見出した。その作用メカニズムについて、肺炎球菌に対しては細胞分裂時の分離異常によって起きる溶菌の亢進であることが示唆された。納豆由来ペプチドは、肺炎球菌に対してムコイド、非ムコイド、薬剤耐性の有無にかかわらず同程度の殺菌活性を示した。

抗ウイルス自然免疫応答解析による上気道疾患病態解明と治療戦略個別化の探索

基盤研究(B)

研究期間:

2014年04月

2018年03月

氷見徹夫, 横田伸一, 高野賢一, 小笠原徳子

RSV感染で誘導されるⅠ，Ⅲ型インターフェロンの産生をクラリスロマイシン(CAM)は抑制した．これには転写因子としてのIRF３が関与しているが，CAMはIFN-βのプロモーター領域の転写因子活性を抑制することが分かった．RSVで誘導されるリン酸化にはCAMは関与していないが，CAMはpoly I:CやRSV感染によりIRF3の二量体形成，細胞質から核内への移行するのを阻害してすることで炎症性サイトカイン産生やIFN誘導抑制効果を示すと考えられ，気道上皮のウイルス炎症を抑制する薬剤の新たな機序を解明した．また，ストレス顆粒やNIP-SNAPとウイルス性炎症とのかかわりを解明した．

AD患者皮膚における皮膚バリアタンパク・シスタチンAの発現解析

若手研究(B)

研究期間:

2014年04月

2017年03月

菅裕司, 山下利春, 澄川靖之, 横田伸一

シスタチンAは皮膚に存在し抗ウイルス作用を有するタンパクとして知られている. 30症例のアトピー性皮膚炎(AD)患者皮膚のシスタチンAを免疫染色したところ, AD皮膚病変部, 健常部ともに, シスタチンAの発現が正常皮膚に比し有意に減弱していた. HaCaT細胞にヘルペスウイルス1，2型, アデノウイルス5型を感染させたところ, シスタチンAがこれらのウイルスDNA量, タンパク合成量を抑制した. バリア機能が低下しているADではその減少の結果, カポジ水痘様発疹症をはじめとするヘルペスウイルス感染症にきたし易くなると考えられた. 将来的にシスタチンAはこれらの感染症の新たな治療法となりうる.

黄色ブドウ球菌、常在細菌群のアレルギー性鼻炎病態に及ぼす影響、その基礎的検討

基盤研究(C)

研究期間:

2013年04月

2016年03月

斎藤慎二, 大庭良介, 横田伸一, 簗瀬晴香

「黄色ブドウ球菌の定着・共生を発端に定着菌－鼻腔上皮細胞間で展開されるコミュニケーション応答により鼻腔環境でのアレルギー応答に変調をもたらす」という仮説の検証を行うため、その基礎的研究モデルの構築を試みた。ヒト鼻腔上皮細胞株を長期気相液相界面培養することで分化を誘導された。タイトジャンクション構成タンパク質の発現・分布を調べたところ、トリセルリンの細胞境界への局在が確認され、液相培養下では見られなかったタイトジャンクション形成が観察された。長期液相気相界面培養により、よりヒト正常鼻腔上皮組織細胞に近いin vitro 鼻腔上皮モデルの構築の可能性が高まった。

がん治療へむけた分子シャペロン補因子ＨＯＰの阻害剤の創出

若手研究(B)

研究期間:

2013年04月

2015年03月

山本聡, 伊藤英晃, 久保田広志, 山口芳樹, 横田伸一

分子シャペロン補因子HOP (HSP70/HSP90 Organizing Protein)は、HSP70とHSP90間の基質移行に関与する。本研究では、がん治療へむけて(1) HOPの生理機能の阻害する化合物の探索・同定することを目的とした。加えて機能評価のため、(2)新規生理機能であるATP加水分解の生化学的解析を行った。 (1)一次スクリーニングによって、計142個の化合物を同定した。更に、二次スクリーニングを実行し、28個の化合物がHOPと結合することを明らかとした。(2) 生化学解析によって、HOPのATP加水分解の反応速度、結合定数、加水分解に伴う構造変化の詳細を明らかとした。

ピロリ菌の発癌に関わる病原因子としてのリポ多糖の多様性

研究期間:

2012年

2014年

横田伸一

担当区分：研究代表者

腸内乳酸菌の消化管内生き残り戦略:胆汁酸適応に関わる細胞表層機能の解析

基盤研究(B)

研究期間:

2009年

2011年

横田篤, 吹谷智, 森田直樹, 横田伸一

遊離胆汁酸はその細胞膜損傷作用により腸内細菌にとって最も過酷な環境ストレス因子になっている.これまでの研究で,研究代表者らはLactobacillus gasseri JCM1131Tにヒトの主要な胆汁酸であるコール酸に対する適応現象を見出している.これは,対数増殖期の細胞を非致死濃度である4mMのコール酸に30分間暴露した後,致死濃度の15mMのコール酸で処理したところ,7時間後でも生残率がほぼ100%であったのに対し,何も処理しない細胞は生残率が千分の一あるいは一万分の一に急速に低下したというものである.この際の適応細胞では,致死濃度のコール酸による細胞膜の損傷が軽減されていて,適応に伴う細胞膜脂質組成の変化が示唆された. そこで適応細胞と非適応細胞から全脂質を抽出し,それらを中性脂質,糖脂質,リン脂質の3区分に分画した.それぞれの画分の比率は適応前後で変化なく,それぞれの画分の脂肪酸組成についても変化がなかった.しかし,糖脂質とリン脂質の組成に有意な変動があった.糖脂質では糖鎖の鎖長が長くなった.またリン脂質ではカルジオリピンの比率が有意に増大した. コール酸適応におけるカルジオリピンの役割について調べるため,ベシクル実験を行った.その結果,カルジオリピンはコール酸による攻撃に対してベシクルに抵抗性を付与することが分かり,カルジオリピンが適応機構に深く関わっていることが示唆された. 本菌のゲノム上には,カルジオリピンの合成に作用すると考えられる2つのカルジオリピン合成酵素遺伝子が存在する.この遺伝子を単独又は両方欠損させた変異株を構築し,それらの株のコール酸適応能を調べた.単独欠損株ではいずれの株でもリン脂質画分におけるカルジオリピンの存在比が低下したが,コール酸適応により野生株並みに増大し,野生株と変わらないコール酸適応を示した.二重変異株ではカルジオリピンが殆ど検出されなかったが,それにも拘わらず,コール酸適応を示した.したがって,カルジオリピンはコール酸適応に必須ではないことが分かった.しかしこの二重変異株では,糖脂質含量の有意な減少とリン脂質含量の有意な増大が見られ,その変化は適応後により顕著になった.このことはカルジオリピンが細胞膜の脂質組成を決定する重要な役割を担っていることを示している.

新種細菌アロイオコッカスに関する臨床研究、免疫学的研究および抗原構造解析

若手研究(B)

研究期間:

2009年

2010年

播摩谷敦, 藤井暢弘, 横田伸一, 飯田政弘, 氷見徹夫, 山口博之

低毒性であるピロリ菌リポ多糖の炎症反応惹起機構

基盤研究(C)

研究期間:

2008年

2010年

横田伸一

担当区分：研究代表者

著しく低いエンドトキシン活性しか示さないHelicobacter pyloriのリポ多糖 LPS)がToll-like receptor 2(TLR2)からシグナルを入れ、TLR4 発現の低い胃粘膜上皮細胞株のTLR4発現を上昇させた。H.pylori LPSがTLR4発現誘導により胃の上皮細胞の他の細菌由来LPSに対する感受性を増強させること、さらに細胞の増殖を亢進させることで、発癌をもたらす病原因子として関与していることが示唆された。

TLR情報伝達系によるウイルス増殖性の制御に関する研究

基盤研究(C)

研究期間:

2008年

2010年

藤井暢弘, 横田伸一, 岡林環樹

細胞の分裂や増殖を伴う活性化がウイルスの増殖性に如何なる影響を与えるかについて検討した。急性感染、持続感染のモデルをリンパ球系細胞、上皮系細胞で構築し、TLR情報伝達系をLPS,熱ショック蛋白、イミキモド等で活性化し細胞培養上清中の遊離ウイルス量を測定した。その結果、リンパ球系や単球系細胞に持続感染している麻疹ウイルス、ムンプスウイルス、単純ヘルペスウイルス1型(HSV1)の遊離ウイルス量には大きな変化は認められなかった。しかし、上皮系細胞であるFL細胞をイミキモドで処理した場合は、インターフェロン非依存的にHSV1の増殖は有意に抑制された。

新種細菌アロイオコッカスに関する基礎的、臨床的研究

若手研究(B)

研究期間:

2007年

2008年

播摩谷敦, 藤井暢弘, 横田伸一, 氷見徹夫, 山口博之, 染川幸裕

ウイルスの宿主免疫抑制機構の解除に着目した抗ウイルス薬創製の基盤的研究

基盤研究(C)

研究期間:

2006年

2007年

横田伸一

担当区分：研究代表者

麻疹の病態形成においてウイルスによる免疫抑制とそれにともなう細菌の二次感染が重要と考えられており、様々な免疫抑制機構が提唱されている。私達は、単球系の細胞株で麻疹ウイルス感染によって、転写因子NF-κBの.活性化が抑制されていることを見出した。この現象が麻疹ウイルスによる新奇の免疫抑制機構と考え、その分子機序を検討した。ヒト単球系細胞株THP-1およびU937の麻疹ウイルス持続感染細胞株を作製した。感染細胞は、LPS刺激によるIL-8誘導およびNF-κBの活性化がほとんど認められなかった。LPS刺激によって誘導されるTAB2とTRAF6の結合が認められず、NF-κB活性化の情報伝達に必須なTAK1/TAB2/TRAF6複合体の形成がウイルスによって抑制されていると推定した。感染細胞で宿主のNF-κBのネガティヴレギュレーターであるA20の発現増強が認められ、RNAiを用いたA20の発現抑制により、LPSによるIL-8産生誘導が回復した。また、ウイルスのphosphoprotein(P蛋白質)のA20プロモターへの間接的な相互作用と、転写活性化能が認められた。一方、上皮系の感染細胞株では恒常的なNF-κB活性化が認められた。以上の結果から、麻疹ウイルスのP蛋白質が感染単球系細胞で宿主のA20を恒常的に発現させることによって、ウイルス自体あるいはLPS刺激によるNF-κBの活性化を抑制していると推定した。麻疹ウイルスが血球細胞に感染し、血行性に全身感染へ移行する過程において、炎症反応を惹起しない状態の感染単球系細胞は、宿主からの排除を逃れることで全身移行に有利にはたらいていると考えた。P蛋白質欠損ウイルスが、宿主免疫抑制を起こさないウイルスの候補として、ワクチンなどへの応用が期待される。

ウイルス感染ヒト神経系細胞における自然免疫系変動の解析

基盤研究(C)

研究期間:

2006年

2007年

藤井暢弘, 横田伸一, 岡林環樹

神経系細胞、オリゴデンドロサイトMO3.13、シュワン細胞ST88-14、グリオーマU118MG、未分化神経細胞NT2を用いてインターフェロン(IFN)感受性-IFN情報伝達系-、Toll-like receptor(TLR)発現、TLR情報伝達系についてウイルス未感染、感染による変化をそれぞれ検討した。 1.IFN情報伝達系:これらの細胞はいずれもIFN処理によりIFN誘導遺伝子である2-5AS(オリゴアデニル酸合成酵素)の誘導が認められることから正常レベルのIFN応答能を有することが判明した。但し、MO,ST,NT2はIFN-γに対する反応性は欠損していた。興味のあることにNT2のIFN-γによるTLR4の誘導性は保持されていた。ムンプスウイルス(MuV),麻疹ウイルス(MeV)感染ではIFN情報伝達系は抑制され、MuV感染でSTAT1、STAT3の分解が認められた。IFN情報伝達系の抑制に関らず、これらのウイルス感染ではMDA5の誘導が認められた。 2.TLR発現・情報伝達系:用いた全ての細胞でTLR3の発現は認められず、IFN(α、β、γ)処理、ウイルス感染によっても発現は誘導されなかった。TLR4はNT2以外の細胞では恒常的に発現していた。NT2のTLR4発現はIFN処理によって有意に回復した。TLR7はU118以外の細胞では恒常的に発現していた。U118での発現はIFN処理によって回復した。神経系の細胞におけるウイルス感染によるサイトカイン(IL6、IL8、RANTES)の産生は体細胞系(上皮系細胞)に比べて低い傾向にあった。

ヘルペスウイルスの増殖にかかわる宿主細胞情報伝達系の修飾

基盤研究(C)

研究期間:

2002年

2004年

横田伸一

担当区分：研究代表者

単純ヘルペスウイルス1型(HSV-1)感染によって宿主細胞のインターフェロン(IFN)に対する反応性が抑制される機構とその意義について解析を行った。HSV-1感染のごく初期(1時間以降)に宿主細胞内のJAK/STAT情報伝達系の負の調節因子のひとつであるsuppressor of cytokine signaling 3(SOCS3)の発現誘導が起こり、それがHSV-1感染初期のIFN情報伝達系抑制を担っていることを示した。結果として、IFN誘導性の抗ウイルス状態が解除される[Yokota et al.(2004)J.Virol.78,6282-6286]。 SOCS3の発現誘導は細胞株によって異なり、誘導能の高い細胞(羊膜細胞FL、T細胞株CCRF-CEM)ではウイルスの著しい増殖が起こりlytic infectionとなるが、発現誘導がほとんど起こらない細胞(単球系細胞株U937,THP-1、B細胞株AKATA)では低い力価のウイルスを産生し続けるprolonged infectionの状態になることを見出した。 FL細胞の系でSOCS3の発現をアンチセンスオリゴヌクレオチドで抑制させると感染後のウイルスの増殖が著しく抑制された。SOCS3の発現誘導はSTAT3によって制御されていることから、その上流のjanus kinase(JAK)の阻害剤の効果をみたところ、Jak3阻害剤がHSV-1によるSOCS3の発現誘導を抑制することを見出した。Jak3阻害剤WHI-P131は、FL細胞でのHSV-1の増殖を著明に抑制した。また、WHI-P131によるHSV-1増殖抑制はIFN-αおよびβの中和抗体添加により有意に解除された。本研究では、HSV-1感染によるSOCS3の誘導が、HSV-1の宿主細胞内での増殖に必要なひとつの要素であり、その役割はIFNによる抗ウイルス活性成立の抑制であることが示された。また、SOCS3発現誘導をコントロールすることによるHSV-1の増殖抑制は、ウイルス感染治療の新規ターゲットとして期待される。

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