共同研究・競争的資金等の研究課題 - 鈴木　拓

全エクソンシークエンスによる大腸癌の染色体不安定性の原因となる新規遺伝子の同定

基盤研究(C)

研究期間:

2013年04月

-

2017年03月

 

澤田 武, 山野 泰穂, 菅井 有, 野島 正寛, 鈴木 拓, 山本 英一郎

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検体の確保の問題、費用の問題から研究対象を変更し、特定の大腸前癌病変（鋸歯状病変）において、遺伝子メチル化の解析と、臨床病理学的因子との関連の検討を行った。結果、遺伝子メチル化の多寡と腫瘍の局在に強い関連があることを見出した。それにより、S状結腸より近位に存在する鋸歯状病変は発癌可能性が高いため、治療が望ましいことが明らかとなった。さらに、病変の背景粘膜において、部位ごとの遺伝子メチル化の差がないことを見出し、鋸歯状病変には領域がん化（field cancerization）の関与が乏しいことを確認した。

てんかん症例のバルプロン酸誘導多嚢胞性卵巣症候群のエピジェネティクス研究

基盤研究(C)

研究期間:

2013年04月

-

2017年03月

 

遠藤 俊明, 鈴木 拓

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本研究では、てんかん合併女性においては、抗てんかん薬でかつHistone の脱アセチル化阻害剤でもあるVPAを幼小児期から投与された場合、卵巣形態はPCOSになっていた。また胎児期にVPAに暴露されたラットの場合も同様の卵巣形態だった。インスリン抵抗性を合併するZucker fa/faラットの卵巣がDNAのmethylationが報告されているが、そのPCO形態がPioglitazone投与で改善した。また胎児期にアンドロゲンに暴露された場合、生まれてからのDNAのhypermethylationが起こっていることが報告されているが、今回の研究では雌仔の卵巣がPCO形態だった。

機能的アッセイによる悪性黒色腫の腫瘍関連遺伝子の同定と解析

基盤研究(C)

研究期間:

2013年04月

-

2016年03月

 

山下 利春, 鈴木 拓, 肥田 時征

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DNA脱メチル化剤5-aza-dC存在下でIFN-βによるアポトーシスが誘導されるメラノーマ細胞株を用いて, 細胞死に関係するmiRNAを網羅的に解析した。発現抑制と上流配列のメチル化を認めた6種類のmiRANAを同定した。そのうちmiR-596は20株のメラノーマ細胞において上流配列に高度メチル化を認め, miR-596前駆体の導入によりメラノーマ細胞の増殖が抑制された。5-aza-dC + IFN-βによるメラノーマ細胞の増殖抑制はmiR-596が関与することが示唆された。外科切除したメラノーマ検体は色素性母斑に比べてmir-598のメチル化レベルが高かった。

大規模エピゲノム解析に基づく革新的消化器癌診断法の開発

基盤研究(A)

研究期間:

2011年04月

-

2014年03月

 

今井 浩三, 鈴木 拓, 谷口 博昭

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大腸癌細胞のエピゲノムおよびトランスクリプトームを解析することで、エピジェネティックに不活化されたマイクロRNA遺伝子を同定した。大腸前癌病変および早期癌のエピゲノム・ゲノム解析を行うことで、早期発見マーカー候補となりうるDNAメチル化異常を同定した。さらに大腸癌前癌病変における内視鏡所見、病理所見、DNAメチル化異常の間の新たな相関を明らかにした。また胃癌背景胃粘膜におけるエピゲノム解析から、胃癌リスクマーカー候補となるDNAメチル化異常を同定した。原発性肝癌におけるエピゲノム異常解析から、新たな癌特異的DNAメチル化異常を複数同定した。

大腸癌幹細胞の性質を規定するエピゲノムおよび機能性ＲＮＡの解明

基盤研究(C)

研究期間:

2011年

-

2013年

 

鈴木 拓

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大腸癌細胞のエピゲノムおよびmicroRNA発現を解析することで、大腸癌においてエピジェネティックに不活化されたmicroRNA遺伝子を複数同定した。大腸癌幹細胞性質にDNAメチル化酵素1型（DNMT1）が必要であることを明らかにし、さらにcancer initiating cellにおいて発現が変化するmicroRNAを複数同定した。大腸発癌過程におけるゲノム・エピゲノム変化を解析することで、発癌早期における分子異常を明らかにした。また前癌病変のDNAメチル化と内視鏡所見を統合解析することで、CpGアイランドメチル化形質（CIMP）陽性前癌病変の診断に有用な形態変化を明らかにした。

消化管癌におけるマイクロRNAおよびエピゲノム異常の解析とその臨床応用

基盤研究(B)

研究期間:

2011年

-

2013年

 

篠村 恭久, 能正 勝彦, 山本 博幸, 鈴木 拓

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ノンコーディングRNAの一つであるマイクロRNAの発現異常は多くの癌で報告され、新規バイオマーカーとして有望であると報告されている。我々は内視鏡切除された早期胃癌患者の非癌部の胃粘膜における microRNA-34b/c(miR-34b/c)遺伝子のメチル化レベルが癌の異時性発生リスクを予測する有望なバイオマーカーとなる可能性を明らかにした。また我々は大腸癌症例においてもマイクロRNAアレイによって同定されたBRAF遺伝子変異と有意な相関を示すmicroRNA-31(miR-31)の同定に成功した。miR-31が大腸癌の不良な予後とも相関し、大腸癌細胞株を用いた機能解析ではmiR-31はRAF の活性化を制御することや標的治療のターゲットとなる可能性についても明らかにした。またこのmiR-31はEGFR下流シグナルを制御する可能性があるため、抗EGFR抗体薬投与例を対象に効果予測マーカーとしての有用性についても検討した。その結果、miR-31高発現群では無増悪生存期間が有意に短いことが明らかとなったことからmiR-31が大腸癌の分子診断・標的治療の有望なバイオマーカーとなる可能性を示唆している。このように消化器癌を対象としたマイクロ RNA やエピゲノムの解析は新たな治療戦略として有望と考えられる。

消化管癌の間質エピゲノムからアプローチする癌幹細胞ニッチの病態解明

挑戦的萌芽研究

研究期間:

2011年

-

2012年

 

篠村 恭久, 鈴木 拓

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消化管癌の癌細胞・背景粘膜・間質におけるエピゲノム異常を解析するため、網羅的DNAメチル化解析を行った。Methylated CpG islandAmplification (MCA)マイクロアレイ法およびバイサルファイト・パイロシークエンス法による解析の結果、胃癌細胞のみならず間質細胞において、SFRP1やmiR-34b/cなど癌関連遺伝子のメチル化を検出した。さらに胃癌および背景粘膜の網羅的DNAメチル化解析から、RASGRF1遺伝子のメチル化を同定し、胃粘膜におけるRASGRF1メチル化が胃癌リスクマーカーとなりうることを明らかにした。

がん研究分野の特性等を踏まえた支援活動

新学術領域研究(研究領域提案型)

研究期間:

2010年04月

-

2016年03月

 

今井 浩三, 中村 祐輔, 井上 純一郎, 中村 卓郎, 石川 冬木, 山村 研一, 荒木 喜美, 八尾 良司, 高野 洋志, 高倉 彰, 加藤 秀樹, 中潟 直己, 豊國 伸哉, 鰐渕 英機, 小川 勝洋, 三森 国敏, 山田 泰広, 渋谷 淳, 今井田 克己, 二口 充, 神田 浩明, 田中 英夫, 若井 建志, 三上 春夫, 鈴木 貞夫, 三浦 克之, 渡邊 能行, 有澤 孝吉, 田中 恵太郎, 嶽崎 俊郎, 古庄 憲浩, 内藤 真理子, 大中 佳三, 喜多 義邦, 栗木 清典, 玉腰 暁子, 江口 英孝, 久保 充明, 浜島 信之, 永田 知里, 樋野 興夫, 田原 栄俊, 椙村 春彦, 津金 昌一郎, 中杤 昌弘, 高山 哲治, 赤座 英之, 高橋 悟, 塚本 泰司, 内藤 誠二, 舛森 直哉, 横溝 晃, 並木 幹夫, 藤本 清秀, 藤岡 知昭, 堀江 重郎, 森 満, 森脇 久隆, 清水 雅仁, 神奈木 真理, 石田 高司, 松岡 雅雄, 山岡 昇司, 田中 勇悦, 渡邉 俊樹, 安井 寛, 土屋 永寿, 醍醐 弥太郎, 宮城 洋平, 高橋 隆, 矢守 隆夫, 清宮 啓之, 上原 至雅, 吉田 稔, 井本 正哉, 深澤 秀輔, 掛谷 秀昭, 旦 慎吾, 冨田 章弘, 川田 学, 長田 裕之, 松浦 正明, 水上 民夫, 馬島 哲夫, 牛嶋 大, 時野 隆至, 鈴木 拓, 篠村 恭久, 能正 勝彦, 宮園 浩平, 稲澤 譲治, 広田 亨, 野田 哲生, 鈴木 操, 竹田 直樹, 柳沼 克幸, 杉谷 善信, 伊藤 秀美, 細野 覚代, 岩崎 基, 永瀬 浩喜, 西夛 裕樹, 古野 純典, 橋本 修二, 山口 一成, 高野 淳, 寺本 晃治, 松田 浩一, 田中 祐吉, 青木 一郎, 長村 義之, 中村 直哉, 鈴木 登, 田尻 道彦, 川崎 隆, 横瀬 智之, 柳澤 聖, 平川 晃弘, 飯島 祥彦, 前佛 均, 佐々木 泰史, 井戸川 雅史, 丸山 玲緒, 甲斐 正広

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がんの克服を目指す研究への支援から始まり、平成26 年度からは広く生命科学研究に携わる研究者も対象として支援を展開した。その結果、総括支援活動では若手研究者の育成ならびに今後研究支援に携わる可能性のある人材を育成し、国際学術交流を展開した。遺伝子改変マウスの供給支援、がん組織をはじめバイオリソースの提供支援等により、多くの世界的・先端的研究が展開された。日本を代表する疫学・ATL 研究では、得られた貴重な試料は11万検体を超え、多くの研究者を支援し貴重な成果を生み出した。化学療法基盤支援、ゲノム・エピゲノム支援は当初の目標を上回る成果を上げた。さらに市民講演会等により国民に支援の重要性を広報した。

消化器癌細胞および癌幹細胞の網羅的エピゲノム解析

若手研究(B)

研究期間:

2009年

-

2010年

 

鈴木 拓

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消化器癌細胞および消化器癌幹細胞に特徴的なエピゲノムパターンを明らかにするため、マイクロアレイおよび次世代シークエンサーを用いて大腸癌細胞における遺伝子発現、miRNA発現およびヒストンメチル化をゲノムワイドに解析した。また、内視鏡切除された大腸癌臨床検体のDNAメチル化およびピストン修飾解析を行った。得られたエピゲノムデータを解析することで、大腸癌においてエピジェネティックに不活化したmicroRNA遺伝子を複数同定した。今回の研究から大腸癌における大規模エピゲノムデータが得られ、それらの情報を癌関連遺伝子やmiRNAの同定に応用できることが示された。

炎症を基盤とした未分化型胃癌のエピジェネティクス解析と発癌リスク予測

基盤研究(B)

研究期間:

2008年

-

2010年

 

篠村 恭久, 山本 博幸, 鈴木 拓

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本研究では、Helicobacter pyloriにより誘発される胃炎・胃癌におけるDNAメチル化異常を明らかにすることで胃癌リスク予測に応用しうる知見を得た。まず胃癌ハイリスク群では癌関連遺伝子のメチル化のみならず、ゲノム全体のメチル化量に変化があることを明らかにした。また胃癌細胞におけるDNAメチル化の網羅的解析から、新規胃癌関連遺伝子およびmicroRNA遺伝子のメチル化異常を見いだした。これらが胃癌抑制遺伝子候補であること、さらにこれらの遺伝子のメチル化が胃癌リスクマーカーとなり得ることを明らかにした。

新規エピゲノム解析技術の開発と消化器癌の個性診断・個別化治療への応用

基盤研究(B)

研究期間:

2007年

-

2008年

 

豊田 実, 鈴木 拓

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消化器癌においてジェネティックな異常に加え、DNAメチル化やヒストン修飾異常などのエピジェネティックな異常が関与する。ゲノム上の多数の遺伝子がエピジェネティックな異常を有すると考えられ、その全貌を明らかにすることは、消化器癌の診断および治療法開発の上で重要である。本研究では、ゲノム網羅的メチル化解析法と多数の検体を定量的に解析する方法の開発を目指す。Methylated CpG island amplification (MCA)法により、メチル化しているCpG islandを効率よく増幅し、大腸癌細胞株から抽出したDNAから作成したMCAアンプリコンをCy5で、正常大腸組織より抽出したDNAから作成したMCAアンプリコンをCy3でラベルし、Agilent社のwhole genome promoter arrayにハイブリダイズすることにより得られたシグナルを解析し、高メチル化している遺伝子を同定した。また、得られた結果を、ゲノムブラウザBLAT上に表示し、クロマチン免疫沈降法(ChIP on ChIP)のデータと比較することにより、DNAメチル化、ヒストンH3リジン4、リジン27のメチル化との統合解析を可能にした。DNMTあるいはDicerを遺伝学的にノックアウトした大腸癌細胞を用いて、MCA microarrayを行い、DNAメチル化およびヒストン修飾のプロファイルを作成した。本研究により開発された新しいエピゲノム法により消化器癌発生の分子機構の解明や、診断や治療の標的遺伝子の同定に有用と考えられる。

エピジェネティックな異常による消化器癌発生の分子機構と診断・治療への応用

基盤研究(S)

研究期間:

2005年

-

2009年

 

今井 浩三, 篠村 恭久, 豊田 実, 山本 博幸, 有村 佳昭, 鈴木 拓, 遠藤 高夫

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発癌におけるエピジェネティックな異常の分子機構に関して未知の点が多い。DNAメチル化は、RASやWNT、p53、microRNAなど細胞内シグナルに重要な遺伝子の不活化に関与する。また、細胞老化に関連するIGFBP7の不活化が、CIMP陽性腫瘍が細胞老化を回避する機構として重要であることを明らかにした。DNAメチル化は大腸粘膜剥離液などの献体から検出可能で、癌の診断に有用であると考えられた。

癌関連遺伝子のエピジェネティックな不活化の分子病態解明

若手研究(A)

研究期間:

2005年

-

2007年

 

鈴木 拓

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癌におけるエピジェネティックな異常,特にDNAメチル化は近年盛んに研究されているが,その背景にあるメカニズムは依然不明である。本研究者は癌細胞におけるRNAi経路とDNAメチル化との関連を解析するため,大腸癌細胞HCT116およびDICERノックアウトHCT116細胞(HCT116ex5)における遺伝子サイレンシングの状態を比較した。SFRP1,-2,-5,CHFRなど既知の遺伝子の発現抑制およびメチル化に変化はなかった。しかし,SFRP4のCpGアイランドのメチル化減少および発現上昇がHCT116ex5細胞で認められた。そこで次にマイクロアレイ解析により発現プロファイルを比較した。その結果,DICERex5細胞ではWTと比較して約2200個の遺伝子発現上昇が認められた。そのうち約1000個は,WT細胞をDNAメチル化阻害剤5-aza-2'-deoxycytidtneで処理した際に上昇する遺伝子と一致した。さらにマイクロアレイにより同定された遺伝子の中から,ICAM1など8遺伝子のCpGアイランドをbisulfiteシークエンス解析した結果,メチル化の消失あるいは減少が認められた。またChIP解析の結果,DICER ex5細胞のICAM1およびSFRP4のCpGアイランドにおいてヒストンメチル化レベルの変化が認められた。これらの結果から,癌細胞におけるエピジェネティックな遺伝子サイレンシングの維持にDICERが必要であることが示唆された。本研究の結果は,ヒト癌細胞においてエピジェネティックな遺伝子サイレンシングにRNAi経路が関与している証拠となりうると考えられる(Cancer Research,in press)。

消化器癌におけるWntシグナルネットワーク破綻の評価システムの構築

萌芽研究

研究期間:

2005年

-

2006年

 

今井 浩三, 鈴木 拓

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癌におけるエピジェネティックな異常、特にDNAメチル化異常は近年盛んに研究されている分野である。Wntシグナル経路の異常は大腸癌において極めて高頻度に見られる現象である。申請者はまず、Wntおよびその受容体であるFrizzledと直接結合することでシグナルの細胞内への伝達を阻害する分泌型Frizzled関連蛋白(SFRP)遺伝子が大腸癌においてきわめて高頻度に不活化していることを発見した。現在、我々は大腸癌、胃癌をはじめとする消化器癌におけるWnt関連遺伝子の異常の解明を進めつつある。 我々は新たに、SFRPファミリーとは別のWnt阻害蛋白であるDickkopf(DKK)ファミリー(DKK1,DKK2,DKK3)が、大腸癌をはじめとする消化器癌においてDNAメチル化によって不活化されていることを発見した(論文投稿中)。大腸癌におけるDKK1、DKK2、DKK3のメチル化頻度はそれぞれ12%、78%、21%、胃癌における頻度は、48%、84%、39%であり、消化管癌において高頻度にメチル化していた。また、大腸腺腫におけるDKK1、DKK2、DKK3メチル化頻度は3%、83%、24%であり、DIK遺伝子メチル化は大腸発癌の早期に発生する異常であると考えられた。また、DKK遺伝子が不活化した大腸癌細胞にDKK1、DKK2、DKK3をそれぞれ発現させたところ、増殖抑制効果が確認された。 我々のこれまでの結果から、SFRPファミリー、DKKファミリー、WIF1という3つのカテゴリーのWnt阻害タンパクが、いずれも大腸癌において主にエピジェネティックなメカニズムで不活化されていることが明らかとなった。これらの成果は大腸癌におけるWntシグナル異常のメカニズムを一層明らかにすると共に、診断・治療への応用に寄与するものと考えられる。

生体分子修飾の異常を標的とした消化器癌の個別化治療

基盤研究(B)

研究期間:

2005年

-

2006年

 

豊田 実, 鈴木 拓

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消化器癌の発生と進展において、様々な生体分子の修飾異常が関与する。中でも、遺伝子のエピジェネティックな異常は遺伝子サイレンシングに関与する。特にアポトーシス関連遺伝子の異常メチル化による不活化は、腫瘍細胞のアポトーシス抵抗性、抗癌剤の低感受性に重要な役割を果たす可能性がある。腫瘍細胞におけるアポトーシスは、DNA損傷や酸化ストレスなど様々なストレスにより誘導される。本研究では、これまで報告がほとんどない、低酸素誘導性アポトーシスに関連する遺伝子群の異常メチル化と発現抑制について検討し、,BH3 Onlyファミリー遺伝子の一つ、BNIP3が大腸癌、胃癌および膵癌において、異常メチル化により不活化されていることを明らかにした。BNIP3が発現していない腫瘍細胞においても、異常メチル化を解除することにより、低酸素誘導性のBNIP3発現が回復しアポトーシスを誘導出来た。われわれはこれまで、一部の大腸癌において、ゲノムワイドなメチル化の異常、CpGアイランドメチル化フェノタイプを示すことを明らかにした。本研究では、胃癌におけるCpGアイランドメチル化フェノタイプにと関連する臨床病理学的因子の検討を行い、Epstein-Barrウイルス関連胃癌においてゲノムワイドなメチル化の異常が起きていることを明かにした。さらに、細胞周期調節遺伝子、特に分裂期チェックポイントに関連する遺伝子のDNAメチル化解析し、CHHR遺伝子の異常メチル化が、微小管阻害剤感受性の予測に有用であることを明らかにした。また、CHFRをRNA干渉法でノックダウンすることにより、微小管阻害によりおこる、分裂期チェックポイントを解除し、腫瘍細胞の微小管阻害にたいする感受性を増強することが可能であった。CHFRの機能を阻害する薬剤は微小管阻害の抗腫瘍作用を増強すると考えられ、分裂期チェックポイント遺伝子の異常が、分子標的として有用である可能性が示唆された。

消化器癌におけるメチル化を指標とした治療法の開発

特別研究員奨励費

研究期間:

2000年

-

2002年

 

鈴木 拓

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これまで大腸癌、胃癌、乳癌、肺癌、白血病など、様々な悪性新生物疾患において、癌抑制遺伝子の高メチル化による不活化が報告されている。我々はマイクロアレイ法を用いて、脱メチル化剤5-aza-2' deoxycytidine(以下DAC)とヒストン脱アセチル化阻害剤Trichostatin A(以下TSA)の組み合わせがヒト大腸癌細胞に及ぼす影響を解析し、高メチル化により不活化されている遺伝子を網羅的に解析した。これまでに低濃度DACおよびTSAの組み合わせ処理により発現上昇する遺伝子を約70個同定し、RT-PCR法で薬剤処理による発現の変化を確認した。この結果、これらの遺伝子群は、その発現パターンから2通りに分類できることが分かった。低濃度DAC処理単独にて弱い発現上昇が見られ、DAC+TSA処理にてさらに発現上昇するが、TSA単独処理では発現に変化を認めないgroup 1と、TSA単独処理によって発現誘導されうるgroup 2である。Group 1遺伝子群の発現回復パターンは、既知のメチル化遺伝子と類似することから、高メチル化がそれら遺伝子の不活化に関与すると推測される。事実、我々は、group 1遺伝子上流のCpG islandをデータベース検索から同定し、その高メチル化を確認している。これに対し、group 2遺伝子群は、我々の上流にCpG islandを有しても、メチル化が認められず、TSAによる発現上昇は従来知られている高メチル化とは別なメカニズムと考えられる。Group 1遺伝子群の中には、染色体部位やこれまで報告されている機能から、新たなtumor suppressorである可能性の考えられるものが複数含まれている。中でも、分泌型frizzled関連蛋白1型(SFRP1)は、大腸癌の癌化に重要なWNT経路を抑制する働きを有しており、機能解析の結果、SFRP1のメチル化による不活化は癌抑制遺伝子APCや、癌遺伝子β-cateninの突然変異と並び、大腸発癌において重要な役割を果たしていることを突き止め、現在さらに解析を進めている。

癌エピジェネティクス