Details of a Researcher - SUZUKI Takeshi

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The mechanism of elongation of primary cilia from basal bodies in ciliogenesis

Grant-in-Aid for Scientific Research (C)

Project Year :

2012

2014

HAGIWARA Haruo, SUZUKI Takeshi, ARISAWA Kenjiro, ASANO Anshin, NAKAKURA Takashi

Authorship： Collaborating Investigator(s) (not designated on Grant-in-Aid)

Primary cilia, an organelle found on nearly every cell in the human body, contain an axoneme, which is composed of microtubules and their associated structures. Lithium ion is known to promote the elongation of primary cilia in a variety of cell types, but it is unknown whether lithium is involved in the acetylation of alpha-tubulin in cilia. Because the acetylation of alpha-tubulin may be important for the elongation of primary cilia, in this study we examined the effects of lithium chloride (LiCl) treatments on the acetylation of alpha-tubulin and length of primary cilia in human fibroblast KD cells. We also investigated the involvement of alphaTAT1 (alpha-tubulin N-acetyltransferase 1) in the signaling pathway mediating glycogen synthase kinase-3beta(GSK-3beta) and adenylate cyclase III. Our results suggested that LiCl treatments activate alphaTAT1 by the inhibition of GSK-3 beta and promote the alpha-tubulin acetylation, and then elongate the primary cilia.

Analysis of endosome/post-endosome system with special reference to water channel aquaporin 2

基盤研究(B)

Project Year :

2006

2009

Kuniaki TAKATA, 鈴木健史, 萩原治夫, 青木武生, 松崎利行, Takeshi SUZUKI, TOSHIYUKI MATSUZAKI, Haruo HAGIWARA, Takeo AOKI

Authorship： Collaborating Investigator(s) (not designated on Grant-in-Aid)

Vesicular trafficking that determines the number of cell surface molecules serves as one of important regulatory mechanisms found in the control of the reabsorption of water in the kidney, maintenance of blood glucose level, etc.Intracellular vesicles involved in the endocytosis and subsequent recycling process, such as endosomes and post-endosomal vesicles are key components in such vesicular trafficking and storage. We used water channel aquaporin 2 whose trafficking is regulated by hypophysial hormone vasopressin. Glucose transporter 4(GLUT4), whose trafficking is regulated by insulin in adipocytes and muscle cells, was coexpressed with aquaporin 2 in MDCK cells, and their localization was visualized by immunofluorescence and GFP-tagging methods. Aquaporin 2 and GLUT4 exhibited distinct localization pattern each other in both the resting and stimulated states, showing that aquaporin 2 and GLUT4 are stored in distinct post-endosomal compartments each other, and that their trafficking is differentially regulated. Translocation of aquaporin 2 has been considered to be regulated by its phosphorylation. We raised antibodies that specifically detect phosphorylated aquaporin 2. By western blotting and immunofluorescence microscopy, phosphorylation of aquaporin 2 was found not only on the cell surface but also intracellular vesicles, suggesting the ubiquitous presence of phosphorylated aquaporin 2.

ライブセルイメージングによる上皮細胞の細胞極性形成機構の解析

Project Year :

2004

2006

ライブセルイメージングによる上皮細胞の細胞極性形成機構の解析

Project Year :

2004

2006

ライブセルイメージングによる上皮細胞の細胞極性形成機構の解析

若手研究(A)

Project Year :

2004

2006

鈴木健史

Authorship： Principal investigator

細胞極性構築過程における膜タンパク質の局在動態を3次元ライブセルイメージングにより解析した.タイトジャンクションフレームワークの構築過程におけるSGLTの分子局在動態をライブセル解析したところ,細胞極性のない状態の細胞で細胞膜全周に発現しているSGLT分子が,タイトジャンクションの完成にともない頂部細胞膜に徐々に濃縮され最終的に頂部細胞膜に限局した局在にシフトしていく様子を,同一の細胞で初めて確認できた.このSGLTの頂部細胞膜への移行や選択的局在に膜脂質が関与している可能性について検討した.コレステロールを急激に除去すると30分でSGLTが細胞膜全周に移行した.この際,タイトジャンクションに変化はなくコレステロールの過剰投与によって相殺されることから,SGLTの頂部細胞膜局在にコレステロールが重要であることを明らかにした.また,コルセミド添加により微小管を脱重合させた場合もSGLTの細胞膜全周への移行が起こることを発見した.この際もタイトジャンクションに変化はなく,上皮細胞シートの電気抵抗性や,他の頂部細胞膜マーカータンパクの染色性に変化がないことから,細胞間接着が壊れた結果の側方拡散による細胞膜全周への移行ではないことを確認した.培地中のコルセミドを洗い流し,通常の培地で培養すると微小管系の復元にともない徐々にSGLTの頂部細胞膜局在が復活する様子も確認した.以上の結果は,微小管系がSGLTの頂部細胞膜局在の維持に機能していることを示している.また,細胞極性は隣接する細胞との接触が引き金となって形成されるが,この細胞接触面にPIP3が一過的に出現することを見いだしている.また,免疫細胞の細胞極性形成過程におけるシグナル分子の動態もライブセルイメージングにより解析し,免疫シナプスにPKCやPIP3,DAGなどの様々なシグナル分子が集合する様子をとらえることに成功した.

Role of Ceveolae on Translocation of Glucose Transporter

基盤研究(C)

Project Year :

2003

2004

Takeo AOKI, Toshiyuki MATSUZAKI, Haruo HAGIWARA, Kuniaki TAKATA, Takeshi SUZUKI

Authorship： Collaborating Investigator(s) (not designated on Grant-in-Aid)

I made GFP fusion protein to have full length of wild type Caveolin-1(human) which was the protein which constituted caveolae toward and transfected into a 3T3-L1 cell and I got selected this by antibiotics stably expressed cells. I was able to get GFP fusion proteins stably expressed cells to have N terminal portion deleted type of this protein. In addition, N terminal deletion type of Caveolin-3 and Caveolin-1 DNA in two places of amino acids mutation of apart of scaffolding domain of Caveolin-1.About a glucose transporter, I compared reaction for insulin stimulation after having guided fat cell differentiation with the 3T3-L1 cell which I transfected a GLUT4-GFP fusion type. As the factor which restrained the formation of caveolae, I transiently tranfected a N terminal portion deleted type (DGV) of Caveolin-3. As the factor which restrained the clathrin formation, I tranfected a C terminal part of AP180 DNA. I stimulated these two cells by insulin. As a result, a translocation of GLUT4 to a cell membrane was restrained by both protein expressions. This got a conclusion that both existence of clathrin coated vesicles and caveolae was restrained in a translocation to a cell membrane of a glucose transporter.I examined a translocation and recycling of aquaporin-2 to compare it with a translocation of GLUT4. I understood that a translocation of aquaporin-2 was obstructed by functional restraint of raft caused by a defect of glycosphingolipid. Furthermore, after recycling, aquaporin retrieved endosomes with Caveolin-1. I understood what was obstructed return to this cell when I transfected caveolin-1 which had variation into two places of amino acids of a part of scaffolding domain which restrained the formation of caveolae.

輸送体膜タンパク質の細胞内局在移送の全行程を生きている細胞でみる

特定領域研究

Project Year :

2002

鈴木健史

Authorship： Principal investigator

生体内コンパートメント間での水移送における水チャネルの役割の細胞構造的研究

特定領域研究(B), 特定領域研究

Project Year :

2001

2004

高田邦昭, 鈴木健史, 青木武生, 萩原治夫, 松崎利行

Authorship： Collaborating Investigator(s) (not designated on Grant-in-Aid)

アクアポリン水チャネル蛋白の中で、バソプレシン刺激により細胞膜と細胞内とを往き来して細胞膜の水輸送活性の調節をおこなっているアクアポリン2の細胞内局在と動態についてアクアポリン2を発現させたMDCK培養上皮細胞を使って解析をおこなった。オルガネラマーカーとの二重染色により、細胞内アクアポリン2はEEA1陽性の初期エンドソームや、Rab11陽性の頂部リサイクリングエンドソームと一部共局在することが判明した。上皮様シートを形成した細胞では、フォルスコリン刺激により細胞のサイクリックAMPレベルをあげると、ほとんどの細胞内アクアポリン2は頂部細胞膜へと移行した。このあとフォルスコリンを除き、シンクロナイズした細胞内への取り込みと細胞内での移行過程を観察した。アクアポリン2はまず初期エンドソームへ入り、ついでRab11陽性の頂部リサイクリングエンドソームへと戻った。頂部細胞膜へ移行するには、Rab11陽性のコンパートメントへ戻ることが必要であり、EEA1陽性コンパートメントはフォルスコリン非感受性であった。サイトカラシンDやラトランクリンB投与すると、細胞内のアクアポリン2は細胞膜をへてすみやかにEEA1陽性のコンパートメントへ移行し、ここに蓄積した。以上の結果から、アクチンは頂部細胞膜に移行したアクアポリン2を膜に保持するのに必要であるとともに、刺激により細胞膜へ移行可能な貯蔵部位への、初期エンドソームからのトラフィッキングにも重要な役割をはたしているのが判明した。

上皮細胞における輸送体膜タンパク質の極性局在機構の分子形態学的解析

奨励研究(A), 若手研究(B)

Project Year :

2001

2002

鈴木健史

Authorship： Principal investigator

頂部細胞膜タンパク質のターゲティングに脂質ラフトが関与していることが近年多く報告されている.そこで,ナトリウムイオン依存型糖輸送体SGLT1の選択的な頂部細胞膜への移送や頂部細胞膜での局在に脂質ラフトが関与している可能性について検討した.このため,生きた細胞内でのSGLT1の動きを観察するために,GFP融合SGLT1をMDCK細胞に導入し安定して発現する株を作製した.この細胞では,コンフルエントの状態になるとSGLT1-GFPは頂部細胞膜のみに局在する.この細胞株を使い,脂質ラフトの主要成分であるコレステロールを除去することにより,SGLT1の頂部細胞膜局在がどのような影響を受けるかを解析した.メチル-β-シクロデキストリン(MCD)処理によって細胞に含まれているコレステロールの急激な除去を行うと,短時間で基底側壁部細胞膜上にもGFPのシグナルが出現し始め細胞膜全周に局在するようになった.この過程を,生きている細胞でタイムラプス観察した結果,MCD処理の影響は15〜30分後から始まり,2時間後には全ての細胞で細胞膜全周に局在するようになった.また,経時的にサンプリングした細胞を蛍光抗体法で解析した結果,SGLT1-GFPが全膜局在する過程におけるタイトジャンクションの染色パターンに変化は見られなかった.このSGLT1-GFPの細胞内局在におよぼすMCDの影響は,培地にコレステロールを添加することによって相殺された.以上の結果は,SGLT1の頂部細胞膜局在にコレステロールラフトが重要な役割を果たしていることを示唆している.

Distribution sugar transporter isoforms and their regulation in the kidney

基盤研究(C)

Project Year :

1999

2002

Keiko FUJIKURA, 鈴木健史, Kuniaki TAKATA

Authorship： Collaborating Investigator(s) (not designated on Grant-in-Aid)

Various transporters, channels, pumps play important roles in the transfer of substances in the kidney. Precise localization and function of these molecules in the kidney are yet to be determined. In this project, we analyzed the localization of sugar transporters and organic cation transporters in the rat kidney. Fructose transporter GLUT5 was concentrated in the apical plasma membrane of S3 segment of proximal tubules in the outer stripe of the outer medulla. Insulin-recruitable sugar transporter GLUT4 was expressed in the cells of Henle's loop. It was localized intracellular compartments especially in the Golgi area including trans-Golgi network. In addition, it was localized in the endosomes. The dynamics of GLUT4 in the cell was analyzed in 3T3-L1 cells expressing green fluorescent protein (GFP)-tagged GLUT4 by the time-lapse microscopy of living cells. GLUT4-GFP was concentrated in the perinuclear region. Branching and fusion of GFP-GLUT4 were seen in this Golgi area. In the GFP-GLUT4 vesicles scattered in the cytoplasm, three types of movement were observed : One is immobile and remained in the same position. The second type of vesicles moved rapidly along the straight line for a long distance. The third type reciprocally moved, rapidly changing the direction of the motion. Organic cation transporters rOCTl and rOCT2 are expressed in the kidney, and their localization was visualized immunfluorescent technique. rOCTl was localized in the convoluted proximal tubules in the cortex, whereas rOCT2 was straight proximal tubules in the outer stripe of the outer medulla. Both transporters were localized along the basolateral plasma membrane, suggesting their role in the transfer of organic cations in the proximal tubules.

水チャンネル蛋白アクアポリンの個体維持における役割の検索

萌芽的研究

Project Year :

1999

2001

高田邦昭, 鈴木健史

Authorship： Collaborating Investigator(s) (not designated on Grant-in-Aid)

アクアポリンは生体膜の水チャネルで、水、グリセロール、尿素などの低分子の生体膜通過に関与する膜蛋白質である。原核生物から動物、植物にまで普遍的に分布し、多種のアイソフォームが体の様々な部位に様々な程度に発現しているが、その生物学的な役割については不明の点が多い。アクアポリン3(AQP3)は尿に接する腎盤、尿管、膀胱、尿道などの尿路上皮、体表を覆う表皮をはじめとする重層扁平上皮、上部と下部の消化管上皮、鼻腔から気管支に至る気道上皮などの細胞に発現していた。その局在部位を、凍結準超薄切片/CCDカメラ蛍光顕微鏡を用いて詳細に観察した。その結果、重層上皮では、基底部から中間層の細胞の細胞膜、単層上皮では基底側壁部細胞膜に局在した。ナノゴールドプローブを用いたプレエンベッディング免疫電顕法により、これらの細胞の部位細胞膜に局在するのが確認された。外気や尿に接する表層の細胞や頂部細胞膜にはAQP3の分布は認められなかった。MDCK細胞では、高浸透圧処理により、AQP3の発現はまずメッセンジャーレベルで、ついで蛋白レベルで増加した。この場合もナノゴールド免疫電顕法により、基底側壁部細胞膜にAQP3は局在した。

ナトリウムイオン依存型糖輸送体SGLT1の頂部細胞膜局在機構の分子形態学の解析

奨励研究(A)

Project Year :

1999

2000

鈴木健史

Authorship： Principal investigator

本研究は,糖輸送体の高度に分化した高等動物組織細胞内での局在分布機構,特に間接的にエネルギーを消費し能動的に糖を細胞に取り込むナトリウムイオン依存型糖輸送体SGLT1の頂部細胞膜への移送経路の解明を目的に行った.SGLT1遺伝子の発現を自在にコントロールする事によってその頂部細胞膜局在メカニズムを移送・局在機構を分離して解析するために,培地に添加するドキシサイクリンの濃度に応じてSGLT1遺伝子発現のオン・オフと発現量を調節できるシステムをMDCK細胞に組み込んだTetOff-SGLT1遺伝子発現システムを構築した.さらにこのシステムを利用し,ドキシサイクリンを培地から除去しSGLT1を発現誘導した後に培地にテトラサイクリンを再添加し遺伝子発現を停止させチェイス培養するパルス発現-チェイス培養システムを構築した.様々な時間チェイス培養した後にMDCK細胞を固定し,発現産物の細胞内局在を,凍結準超薄切片蛍光抗体染色法,共焦点レーザー顕微鏡法,蛍光顕微鏡法,免疫電子顕微鏡法などを組み合わせ解析する事によって,SGLT1が細胞内で合成された後に直接頂部細胞膜に移送されていることが明らかとなった.現在このシステムを用いて,SGLT1の頂部細胞膜への直接的な移送システムが細胞極性形成過程の何処で構築されるのかを解析中である.

Analysis of cell polarity formation by gene transfection in organs in situ

基盤研究(B)

Project Year :

1998

2001

Kuniaki TAKATA, 鈴木雅一, Takeshi SUZUKI

Authorship： Collaborating Investigator(s) (not designated on Grant-in-Aid)

In vivo electroporation and particle gun methods were used to introduce exogenous genes into tissue cells in situ in living animals. Constructs of green fluorescent proteins were tested to optimize the conditions of gene transfection. Glucose transporters (GLUT1, GLUT3, GLUT4, GLUT5, and SGLT1) were introduced into cells of liver and pancreas of living rats. The expressed gene products were visualized by immunofluorescence staining of tissue sections. By optimizing the conditions of transfection, glucose transporters were successfully expressed in highly differentiated cells such as hepatocytes and pancreatic acinar cells forming tissues in situ. GLUT1 was localized to basolateral membrane domains in both hepatocytes and pancreatic acinar cells. GLUT3 and GLUT5 were restricted to apical membrane domain in pancreatic acinar cells. They were found in both the apical and basolateral domains in hepatocytes. These observations suggest differential targeting mechanism in hepatocytes and acinar cells : i.e., apical targeting is carried out by direct pathway in acinar cells, whereas it is mediated by the indirect transcytotic pathway in hepatocytes. GLUT4 was retained in the cytoplasmic compartments in both cell types. Immuno-electron microscopy revealed that GLUT4 resides in the membranes of zymogne secretary granules in acinar cells, showing that GLUT4 is sorted to the regulated secretion pathway in these cells. In addition, in vivo electroporation and particle gun methods are simple and versatile methods to study the localization of exogenous gene products in cells and tissues in situ.

Development of immunohistochemistry using confocal microscopy and microinjection method

基盤研究(B)

Project Year :

1997

2000

Kuniaki TAKATA, 鈴木雅一, Takeshi SUZUKI, Masakazu SUZUKI

Authorship： Collaborating Investigator(s) (not designated on Grant-in-Aid)

In the confocal microscopic examination of biological specimens, localization of nuclei gives important information. We screened fluorescent dyes, originally developed for nucleic acids in gel, for the use in multi-fluorescence microscopy. Among dyes tested SYBR GreenI, SYTOX Green, Pico Green are best suited for green fluorescence, YO-PRO-3 for red fluorescence, and TO-PRO-3 for far red fluorescence. Use of these dyes for nuclear-counter staining in salivary glands proved to give superior confocal images, suitable for the reconstruction of the glands. Localization of aquaporin 5 was clear demonstrated in these complex acinus and duct systems. Nuclear fluorescent counterstaining is also useful in determining the localization of channels and transporters in cultured epithelial cells. For the introduction of exogenous genes into cells, we used microinjection and lipofection methods We transiently expressed GLUT4 glucose transporter in cultured cells, and its immunolocalization and translocation to the plasma membrane was monitored with conventional and confocal fluorescence microscopes. We also used green-fluorescen-protein-tagged GLUT4 and its localization was analyzed. Introduction of exogenous genes, followed by three-dimonsional confocal image analyses proved to be a very convenient and powerful tool in the identification of gene product expressed in the cells.

上皮細胞極性形成過程における糖輸送体の選択的細胞膜局在機構の分子形態学的解析

奨励研究(A)

Project Year :

1997

1998

鈴木健史

Authorship： Principal investigator

本研究の目的は,糖輸送体分子の細胞内局在機構を解明することである.そのため,糖輸送体遺伝子を遺伝子工学的手法によって改変し極性を持つ上皮培養細胞(MDCK細胞)や生体組織細胞に導入発現させ,その挙動をレーザー共焦点顕微鏡法等で観察した.実験には腎臓や小腸上皮細胞で頂部細胞膜に局在する糖輸送体SGLT1を用いた.野生型のSGLT1遺伝子を導入したMDCK細胞を蛍光抗体染色しレーザー共焦点顕微鏡で観察したところ,頂部細胞膜に限局していた.しかし,N末部の膜外突出部位にデリーションやアミノ酸置換などの変異を導入したcDNAクローンを上皮培養細胞に導入したところ頂部細胞膜局在がみだされ,頂部および基底側壁部の全細胞膜に局在するような,あるいは細胞膜には組み込まれず細胞質コンパートメントに局在を示すようになった.頂部細胞膜局在を乱す変異は第一膜貫通領域の直前にある9残基のアミノ酸配列内に限られていた.以上の結果は,SGLT1のN末膜外突出部位にある短い配列が頂部細胞膜局在の調節システムに深く関与していることを示唆する.こうした現象が培養細胞だけでなく実際の生体組織細胞でも起こりうるのかを確認するために,生体組織細胞へ直接cDNAクローンを導入する方法として,生体エレクトロポレーション法を確立した.また,組織に火傷を伴わない方法として,現在ジーンガンによるパーティクルデリバリーシステムの導入を試みている.

細胞膜ミクロドメインの探索

萌芽的研究

Project Year :

1997

1998

高田邦昭, 鈴木雅一, 鈴木健史

Authorship： Collaborating Investigator(s) (not designated on Grant-in-Aid)

MDCK細胞に糖輸送体GLUT1,GLUT5,SGLT1の遺伝子を,リポフェクション法により導入した.これらを物質透過性のある膜のトランスウエル上で培養し上皮様の細胞層を得た.それぞれの糖輸送体に特異的な抗体を用いて蛍光抗体染色し,導入した遺伝子の発現と局在を検討した.同時にタイトジャンクション蛋白のオクルディンを特異抗体で,核をDNA特異的なTO-PRO3で染色し,3チャネル共焦点レーザー顕微鏡で観察した.コンフルエントになった細胞シートでは,GLUT1は基本的にはMDCK細胞の基底側壁部細胞膜に局在した.一方GLUT5とSGLT1はMDCK細胞の頂部細胞膜に局在した.GLUT1,GLUT5,SGLT1の中のどれか二つを用いたコトランスフェクションと蛍光二重染色によっても同様の結果が得られた.GLUT1の発現を時間をおって観察した結果,GLUT1はまず細胞内から細胞膜へ輸送され全周にわたって分布した.やがてGLUT1は基底側壁部細胞膜に多くみられるようになり,最終的には基底側壁部細胞膜に限局して局在した.GLUT5も最初はGLUT1と同様に細胞膜全周にわたって存在したが,頂部細胞膜により多く局在するようになった.一方SGLT1は最初は主に細胞内部に存在し,やがて培養液に接する細胞の頂部に陽性となった.今回の条件ではSGLT1はGLUT5とは異なり,細胞膜全周への局在はほとんど見られなかった.現在,頂部微絨毛を一ヵ所に集める作用のあるジャスプラキンを用いて頂部細胞膜を微絨毛とその他のミクロドメインに分けた場合の分布を,高解像の共焦点レーザー顕微鏡と電顕を使い検討中である.

糖の吸収供給機能を制御する糖輸送体の細胞膜ドメイン局在分布機構の分子形態学的解析

奨励研究(A)

Project Year :

1995

鈴木健史

Authorship： Principal investigator

本研究の目的は,糖輸送体分子の細胞内局在分布機構を解明することにある.このため,糖輸送体遺伝子を遺伝子工学的手法によって改変し,それを極性を持つ細胞に導入発現させ,発現した産物の挙動を高解像度蛍光抗体染色法,金コロイド標識法,レーザーコンフォーカル顕微鏡法等を組み合わせて観察した.その結果、正常なSGLT1は頂部膜ドメインに局在発現し,SMITは基底側壁部に局在発現した.SGLT1のN末部の30アミノ酸を除いた欠失遺伝子の産物は細胞膜全域に発現した.さらに,そのアミノ酸の代わりにSMITのN末部の10アミノ酸を加えたキメラ遺伝子産物は基底側壁部に局在発現した.この結果は,これらの糖輸送体の細胞内局在機構を規定するドメインがN末部の短いアミノ酸配列であることを示している.

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