研究者詳細 - 鈴木　健史

共同研究・競争的資金等の研究課題 - 鈴木　健史

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線毛発生における基底小体からの線毛伸長のｏｎ／ｏｆｆ制御機構の解明

基盤研究(C)

研究期間:

2012年

2014年

萩原治夫, 鈴木健史, 有澤謙二郎, 浅野安信, 中倉敬

担当区分：連携研究者

線毛アクソネーム微小管のチュブーリンアセチル化は、線毛形成と線毛構造保持に重要な因子である。チューブリンのアセチル化には、アセチル化酵素と脱アセチル化酵素が関与する。アルファチューブリンアセチル化酵素（Mec17/alphaTAT1）のRAEGDIKPYSSSDRE配列を抗原として用いて特異抗体を作製した。我々の作製した抗Mec17抗体と市販の抗Mec17抗体、チューブリン脱アセチル化酵素（HDAC6）に対する抗体、および線毛、中心体、微小管、細胞内小器官関連分子に対する抗体を用いて、GFAP-Mec17/alphaTAT1導入細胞、各種の培養細胞系および線毛形成細胞などで目的タンパク質を分子解剖学的に解析した。HDAC6は細胞質内にびまん性に発現し、アセチル化チュブリンとの局在についての規則性は認められなかった。GFAP-Mec17/alphaTAT1導入3Y1-B 細胞では、Mec17は、細胞質内の微小顆粒状構造として観察されたが、ヒト線維芽細胞ではMec17は細胞分裂時の紡錘体に加えて一次線毛を伸長した基底小体の基部領域に強く発現し、線毛形成に深く関係することが考えられた。また、Mec17の発現は長期間培養系で高まり、線毛伸長に加えて線毛の構造維持にも重要な役割を演じると考えられた。リチウム投与時のチューブリンアセチル化酵素（Mec17）と脱アセチル化酵素（HDAC6）発現について、細胞生物学的に解析した。リチウム投与に反応して細胞内アセチル化チューブリンの著名な増加が観察されたものの、HDAC6とMec17はともに発現が低下し、リチウムによる線毛伸長に未知のチューブリンアセチル化関連因子の存在が示唆された。

水チャネル・アクアポリン2をモデルとしたエンドソーム・ポストエンドソーム系の解析

基盤研究(B)

研究期間:

2006年

2009年

高田邦昭, 鈴木健史, 萩原治夫, 青木武生, 松崎利行, 鈴木健史, 松崎利行, 萩原治夫, 青木武生

担当区分：連携研究者

細胞表面機能分子の数が細胞内小胞からの移行や回収により調節される系は、腎臓での水の再吸収や血糖値恒常性の維持機構などにおいて重要な役割を果たしている。このようなエンドソーム・ポストエンドソーム系での小胞トラフィッキングにより調節されているものの中で、水チャネル・アクアポリン2(AQP2)をモデルとしてその分布と調節機構を解析した。アクアポリン2とインスリン刺激によりトラフィッキングの調節がおこるグルコーストランスポーター4(GLUT4)あるいはGFP標識GLUT4をMDCK細胞で同時に発現させたところ、アクアポリン2とGLUT4はそれぞれ独自の分布局在パターンをとった。さらにフォルスコリン刺激によりアクアポリン2を細胞膜へと移行させたり細胞内へのリサイクリング過程を追跡してみても、GLUT4の分布・局在はほとんど影響されなかった。この結果は、アクアポリン2とGLUT4は、ポストエンドソーム域においてその局在と動態はそれぞれ独自のものであることを示していて、ポストエンドソーム域がヘテロな小胞集団であることを示唆している。次にアクアポリン2小胞のリン酸化による調節を、リン酸化アクアポリン2を特異的に認識する抗体を作製し、ウエスタンブロット法と蛍光抗体法や免疫電顕法により観察した。その結果、リン酸化アクアポリン2が細胞内でもある一定レベル存在することが判明した。

ライブセルイメージングによる上皮細胞の細胞極性形成機構の解析

研究期間:

2004年

2006年

ライブセルイメージングによる上皮細胞の細胞極性形成機構の解析

研究期間:

2004年

2006年

ライブセルイメージングによる上皮細胞の細胞極性形成機構の解析

若手研究(A)

研究期間:

2004年

2006年

鈴木健史

担当区分：研究代表者

細胞極性構築過程における膜タンパク質の局在動態を3次元ライブセルイメージングにより解析した.タイトジャンクションフレームワークの構築過程におけるSGLTの分子局在動態をライブセル解析したところ,細胞極性のない状態の細胞で細胞膜全周に発現しているSGLT分子が,タイトジャンクションの完成にともない頂部細胞膜に徐々に濃縮され最終的に頂部細胞膜に限局した局在にシフトしていく様子を,同一の細胞で初めて確認できた.このSGLTの頂部細胞膜への移行や選択的局在に膜脂質が関与している可能性について検討した.コレステロールを急激に除去すると30分でSGLTが細胞膜全周に移行した.この際,タイトジャンクションに変化はなくコレステロールの過剰投与によって相殺されることから,SGLTの頂部細胞膜局在にコレステロールが重要であることを明らかにした.また,コルセミド添加により微小管を脱重合させた場合もSGLTの細胞膜全周への移行が起こることを発見した.この際もタイトジャンクションに変化はなく,上皮細胞シートの電気抵抗性や,他の頂部細胞膜マーカータンパクの染色性に変化がないことから,細胞間接着が壊れた結果の側方拡散による細胞膜全周への移行ではないことを確認した.培地中のコルセミドを洗い流し,通常の培地で培養すると微小管系の復元にともない徐々にSGLTの頂部細胞膜局在が復活する様子も確認した.以上の結果は,微小管系がSGLTの頂部細胞膜局在の維持に機能していることを示している.また,細胞極性は隣接する細胞との接触が引き金となって形成されるが,この細胞接触面にPIP3が一過的に出現することを見いだしている.また,免疫細胞の細胞極性形成過程におけるシグナル分子の動態もライブセルイメージングにより解析し,免疫シナプスにPKCやPIP3,DAGなどの様々なシグナル分子が集合する様子をとらえることに成功した.

グルコーストランスポーターのトランスロケーションにおけるカベオラの役割

基盤研究(C)

研究期間:

2003年

2004年

青木武生, 松崎利行, 萩原治夫, 高田邦昭, 鈴木健史

担当区分：連携研究者

カベオラを構成する蛋白であるCaveolin-1(human)の野性株のCaveolin-1の全長を持つGFP融合体、N末を欠損したGFP融合体を、3T3-L1細胞に導入しこれを安定的に発現する細胞株を選抜して得た。また、Caveolin-1のScaffolding domainの部位のアミノ酸2箇所に変異のある株、やCaveolin-3のN末欠損株も得られた。また、グルコーストランスポーターについては、GLUT4-GFP融合体を導入した3T3-L1細胞で、脂肪細胞分化誘導した後の、インスリン刺激に対する反応を比較した。インスリンの刺激に対して、分化誘導した細胞に、エレクトロポーレイションを用いて、カベオラの形成を抑制する因子として、Caveolin-3の膜貫通部位(DGV)の一時的な導入、およびクラスリン形成を抑制する因子として、AP180のC末部位を一時的に導入してインスリンで刺激した。その結果、両者でGLUT4の細胞膜へのトランスロケーションが阻害された。このことは、グルコーストランスポーターの細胞膜へのトランスロケーションには、クラスリン被覆小胞とカベオラの存在が不可欠であるという結論を得た。GLUT4のトランスロケーションと比較するために、アクアポリン-2のトランスロケーションとリサイクリングについて検討をおこなった、その結果、糖脂質合成の欠陥に起因するラフトの機能抑制によって、アクアポリン-2のトランスロケーションが極めて阻害されることがわかった。さらに、リサイクリングの後、細胞内に戻ったアクアポリンはCaveolin-1と共に初期エンドソームに達するばかりでなく、カベオラの形成を抑制するScaffolding domainの部位のアミノ酸2箇所に変異をもつCaveolin-1を導入すると、この細胞内への復帰が、まったく阻害されることが、わかった。

輸送体膜タンパク質の細胞内局在移送の全行程を生きている細胞でみる

特定領域研究

研究期間:

2002年

鈴木健史

担当区分：研究代表者

生体内コンパートメント間での水移送における水チャネルの役割の細胞構造的研究

特定領域研究(B), 特定領域研究

研究期間:

2001年

2004年

高田邦昭, 鈴木健史, 青木武生, 萩原治夫, 松崎利行

担当区分：連携研究者

アクアポリン水チャネル蛋白の中で、バソプレシン刺激により細胞膜と細胞内とを往き来して細胞膜の水輸送活性の調節をおこなっているアクアポリン2の細胞内局在と動態についてアクアポリン2を発現させたMDCK培養上皮細胞を使って解析をおこなった。オルガネラマーカーとの二重染色により、細胞内アクアポリン2はEEA1陽性の初期エンドソームや、Rab11陽性の頂部リサイクリングエンドソームと一部共局在することが判明した。上皮様シートを形成した細胞では、フォルスコリン刺激により細胞のサイクリックAMPレベルをあげると、ほとんどの細胞内アクアポリン2は頂部細胞膜へと移行した。このあとフォルスコリンを除き、シンクロナイズした細胞内への取り込みと細胞内での移行過程を観察した。アクアポリン2はまず初期エンドソームへ入り、ついでRab11陽性の頂部リサイクリングエンドソームへと戻った。頂部細胞膜へ移行するには、Rab11陽性のコンパートメントへ戻ることが必要であり、EEA1陽性コンパートメントはフォルスコリン非感受性であった。サイトカラシンDやラトランクリンB投与すると、細胞内のアクアポリン2は細胞膜をへてすみやかにEEA1陽性のコンパートメントへ移行し、ここに蓄積した。以上の結果から、アクチンは頂部細胞膜に移行したアクアポリン2を膜に保持するのに必要であるとともに、刺激により細胞膜へ移行可能な貯蔵部位への、初期エンドソームからのトラフィッキングにも重要な役割をはたしているのが判明した。

上皮細胞における輸送体膜タンパク質の極性局在機構の分子形態学的解析

奨励研究(A), 若手研究(B)

研究期間:

2001年

2002年

鈴木健史

担当区分：研究代表者

頂部細胞膜タンパク質のターゲティングに脂質ラフトが関与していることが近年多く報告されている.そこで,ナトリウムイオン依存型糖輸送体SGLT1の選択的な頂部細胞膜への移送や頂部細胞膜での局在に脂質ラフトが関与している可能性について検討した.このため,生きた細胞内でのSGLT1の動きを観察するために,GFP融合SGLT1をMDCK細胞に導入し安定して発現する株を作製した.この細胞では,コンフルエントの状態になるとSGLT1-GFPは頂部細胞膜のみに局在する.この細胞株を使い,脂質ラフトの主要成分であるコレステロールを除去することにより,SGLT1の頂部細胞膜局在がどのような影響を受けるかを解析した.メチル-β-シクロデキストリン(MCD)処理によって細胞に含まれているコレステロールの急激な除去を行うと,短時間で基底側壁部細胞膜上にもGFPのシグナルが出現し始め細胞膜全周に局在するようになった.この過程を,生きている細胞でタイムラプス観察した結果,MCD処理の影響は15〜30分後から始まり,2時間後には全ての細胞で細胞膜全周に局在するようになった.また,経時的にサンプリングした細胞を蛍光抗体法で解析した結果,SGLT1-GFPが全膜局在する過程におけるタイトジャンクションの染色パターンに変化は見られなかった.このSGLT1-GFPの細胞内局在におよぼすMCDの影響は,培地にコレステロールを添加することによって相殺された.以上の結果は,SGLT1の頂部細胞膜局在にコレステロールラフトが重要な役割を果たしていることを示唆している.

腎臓における糖輸送体アイソフォームの分布と調節機構の解析

基盤研究(C)

研究期間:

1999年

2002年

藤倉恵子, 鈴木健史, 高田邦昭

担当区分：連携研究者

腎臓には多彩な輸送体、チャネル、ポンプなどがあり、その輸送機能を担っているが、個々の分子種の局在や役割には不明の点が多い。本研究では、ラット腎臓を用いて、糖などの輸送にかんよする細胞膜糖輸送体の分布と動態について検討を加えた。フルクトース輸送体GLUT5は、RT-PCR、蛍光抗体法組織化学、免疫電顕法などにより、髄質外帯の近位尿細管S3セグメントの頂部刷子縁細胞膜に局在するのが判明した。一方インスリン依存性に細胞内から細胞膜へと移行する糖輸送体GLUT4は、Henleループ細胞の細胞内に分布していた。3T3-L1培養細胞での各種オルガネラマーカーを用いた多重標識では、核近傍のゴルジ野(ゴルジ装置とトランスゴルジネットワーク)からエンドソームにかけて局在するのが判明した。さらにグリーンフルオレッセントプロテイン(GFP)標識したGLUT4を用いて生きている細胞での局在と動態ををタイムラプス顕微鏡法により記録した。その結果、GLUT4-GFPは核近傍のゴルジ野では、GLUT4陽性の小胞や管状の構造が盛んに分岐、融合するのがみられた。また細胞内に分散している小型のGLUT4小胞には、動きの殆ど無いものと、非常に早く線状に動くもの、その中間で往復運動をするものの三種がみられた。また有機カチオン輸送体(OCT)のなかで,rOCT1とrOCT2のラット腎臓での局在について多重蛍光抗体法により検討した.rOCT1は腎皮質の近位曲尿細管に,rOCT2は腎髄質外帯外層の近位直尿細管に分布するのが判明した.rOCT1,rOCT2ともにそれぞれの部位の近位尿細管細胞の基底側壁部に局在していた.これはrOCT1,rOCT2が有機カチオンの近位尿細管への取り込みに関与しているのを示唆している.

水チャンネル蛋白アクアポリンの個体維持における役割の検索

萌芽的研究

研究期間:

1999年

2001年

高田邦昭, 鈴木健史

担当区分：連携研究者

アクアポリンは生体膜の水チャネルで、水、グリセロール、尿素などの低分子の生体膜通過に関与する膜蛋白質である。原核生物から動物、植物にまで普遍的に分布し、多種のアイソフォームが体の様々な部位に様々な程度に発現しているが、その生物学的な役割については不明の点が多い。アクアポリン3(AQP3)は尿に接する腎盤、尿管、膀胱、尿道などの尿路上皮、体表を覆う表皮をはじめとする重層扁平上皮、上部と下部の消化管上皮、鼻腔から気管支に至る気道上皮などの細胞に発現していた。その局在部位を、凍結準超薄切片/CCDカメラ蛍光顕微鏡を用いて詳細に観察した。その結果、重層上皮では、基底部から中間層の細胞の細胞膜、単層上皮では基底側壁部細胞膜に局在した。ナノゴールドプローブを用いたプレエンベッディング免疫電顕法により、これらの細胞の部位細胞膜に局在するのが確認された。外気や尿に接する表層の細胞や頂部細胞膜にはAQP3の分布は認められなかった。MDCK細胞では、高浸透圧処理により、AQP3の発現はまずメッセンジャーレベルで、ついで蛋白レベルで増加した。この場合もナノゴールド免疫電顕法により、基底側壁部細胞膜にAQP3は局在した。

ナトリウムイオン依存型糖輸送体SGLT1の頂部細胞膜局在機構の分子形態学の解析

奨励研究(A)

研究期間:

1999年

2000年

鈴木健史

担当区分：研究代表者

本研究は,糖輸送体の高度に分化した高等動物組織細胞内での局在分布機構,特に間接的にエネルギーを消費し能動的に糖を細胞に取り込むナトリウムイオン依存型糖輸送体SGLT1の頂部細胞膜への移送経路の解明を目的に行った.SGLT1遺伝子の発現を自在にコントロールする事によってその頂部細胞膜局在メカニズムを移送・局在機構を分離して解析するために,培地に添加するドキシサイクリンの濃度に応じてSGLT1遺伝子発現のオン・オフと発現量を調節できるシステムをMDCK細胞に組み込んだTetOff-SGLT1遺伝子発現システムを構築した.さらにこのシステムを利用し,ドキシサイクリンを培地から除去しSGLT1を発現誘導した後に培地にテトラサイクリンを再添加し遺伝子発現を停止させチェイス培養するパルス発現-チェイス培養システムを構築した.様々な時間チェイス培養した後にMDCK細胞を固定し,発現産物の細胞内局在を,凍結準超薄切片蛍光抗体染色法,共焦点レーザー顕微鏡法,蛍光顕微鏡法,免疫電子顕微鏡法などを組み合わせ解析する事によって,SGLT1が細胞内で合成された後に直接頂部細胞膜に移送されていることが明らかとなった.現在このシステムを用いて,SGLT1の頂部細胞膜への直接的な移送システムが細胞極性形成過程の何処で構築されるのかを解析中である.

臓器細胞への遺伝子直接導入法による細胞極性形成機構の解析

基盤研究(B)

研究期間:

1998年

2001年

高田邦昭, 鈴木雅一, 鈴木健史

担当区分：連携研究者

肝臓とは異なる細胞内輸送系を持つと考えられている膵臓を用いて、膜蛋白質である糖輸送体GLUTの局在を検討した。膵臓は、肝臓に比べてエレクトロポレーション時の組織へのダメージが大きいので、導入の条件をGFPゴンストラクトの導入をモデル系としてさらに改良した。糖輸送体のなかでも、GLUT4は細胞内の核上部の細胞質にひろく分布した。微分干渉像と比較すると、チモーゲン顆粒のある部位に相当し、顆粒膜へのターゲッティングが示唆された。アミラーゼ等との蛍光多重染色を試みたが、断定的な結果は得られなかった。そこで、ポストエンベッディング酵素抗体免疫電顕法を用いてオルガネラレベルで観察し、分泌顆粒にあるのを示した。即ち、生体内で調節性分泌をおこなう高度に分化した外分泌細胞にGLUT4を発現させると分泌顆粒膜に保持されるのが明らかになった。こは心臓のANP分泌細胞で、GLUT4が顆粒膜へターゲティングされるのと類似の機構が働くためと推定された。これは、GLUT4の細胞内局在が、一般的に調節性分泌経路へのターゲティングによるであろうことを示唆している。さらに糖輸送体よりは構造の簡単な膜蛋白である水チャネル(アクアポリン)についても、生体エレクトロポレーション法により、ラット肝臓、膵臓へ導入してその局在を検討中である。

共焦点顕微鏡法とミクロインジェクションを組合せた組織細胞解析法の展開

基盤研究(B)

研究期間:

1997年

2000年

高田邦昭, 鈴木雅一, 鈴木健史, 鈴木雅一

担当区分：連携研究者

共焦点レーザー顕微鏡システムを用いて蛍光像の観察をするときに核の局在部位は極めて重要な情報である.多重染色に適用可能なDNA特異的な色素について近年ゲル電気泳動のために開発された色素に着目してスクリーニングし,緑の蛍光色素としてはSYBR Green I,SYTOX Green,Pico Greenが,赤の蛍光色素としてはYO-PRO-3が,ファーレッドの蛍光色素としてはTO-PRO-3が優れていることを見出した.この核染色法は複雑な腺と導管の構造を有する唾液腺における水チャネルのアクアポリン5(AQP5)の分布局在を共焦点スライス像から再構成したり,培養上皮細胞での細胞膜輸送体やチャネル分子の極性を持った分布を観察するうえで,きわめて有効であった.ミクロインジェクション法は糖輸送体遺伝子の培養細胞の導入にリポフェクション法と併行して用いた.このようなトランジェントな発現系で糖輸送体GLUT4を培養細胞で発現させ,その局在を観察した.細胞は固定後,蛍光抗体染色や上記の核染色を用いた標本を共焦点顕微鏡等で観察した.またグリーンフルオレッセントプロテイン-GLUT4を用いて,生きている細胞での動態の観察もおこなった.ミクロインジェクション法をはじめとする方法で,少数の細胞で目的の遺伝子を発現させ,それについて共焦点顕微鏡法を用いて三次元的に詳細に解析する方法は,目的とする遺伝子産物の局在観察のためにきわめて有効であった.

上皮細胞極性形成過程における糖輸送体の選択的細胞膜局在機構の分子形態学的解析

奨励研究(A)

研究期間:

1997年

1998年

鈴木健史

担当区分：研究代表者

本研究の目的は,糖輸送体分子の細胞内局在機構を解明することである.そのため,糖輸送体遺伝子を遺伝子工学的手法によって改変し極性を持つ上皮培養細胞(MDCK細胞)や生体組織細胞に導入発現させ,その挙動をレーザー共焦点顕微鏡法等で観察した.実験には腎臓や小腸上皮細胞で頂部細胞膜に局在する糖輸送体SGLT1を用いた.野生型のSGLT1遺伝子を導入したMDCK細胞を蛍光抗体染色しレーザー共焦点顕微鏡で観察したところ,頂部細胞膜に限局していた.しかし,N末部の膜外突出部位にデリーションやアミノ酸置換などの変異を導入したcDNAクローンを上皮培養細胞に導入したところ頂部細胞膜局在がみだされ,頂部および基底側壁部の全細胞膜に局在するような,あるいは細胞膜には組み込まれず細胞質コンパートメントに局在を示すようになった.頂部細胞膜局在を乱す変異は第一膜貫通領域の直前にある9残基のアミノ酸配列内に限られていた.以上の結果は,SGLT1のN末膜外突出部位にある短い配列が頂部細胞膜局在の調節システムに深く関与していることを示唆する.こうした現象が培養細胞だけでなく実際の生体組織細胞でも起こりうるのかを確認するために,生体組織細胞へ直接cDNAクローンを導入する方法として,生体エレクトロポレーション法を確立した.また,組織に火傷を伴わない方法として,現在ジーンガンによるパーティクルデリバリーシステムの導入を試みている.

細胞膜ミクロドメインの探索

萌芽的研究

研究期間:

1997年

1998年

高田邦昭, 鈴木雅一, 鈴木健史

担当区分：連携研究者

MDCK細胞に糖輸送体GLUT1,GLUT5,SGLT1の遺伝子を,リポフェクション法により導入した.これらを物質透過性のある膜のトランスウエル上で培養し上皮様の細胞層を得た.それぞれの糖輸送体に特異的な抗体を用いて蛍光抗体染色し,導入した遺伝子の発現と局在を検討した.同時にタイトジャンクション蛋白のオクルディンを特異抗体で,核をDNA特異的なTO-PRO3で染色し,3チャネル共焦点レーザー顕微鏡で観察した.コンフルエントになった細胞シートでは,GLUT1は基本的にはMDCK細胞の基底側壁部細胞膜に局在した.一方GLUT5とSGLT1はMDCK細胞の頂部細胞膜に局在した.GLUT1,GLUT5,SGLT1の中のどれか二つを用いたコトランスフェクションと蛍光二重染色によっても同様の結果が得られた.GLUT1の発現を時間をおって観察した結果,GLUT1はまず細胞内から細胞膜へ輸送され全周にわたって分布した.やがてGLUT1は基底側壁部細胞膜に多くみられるようになり,最終的には基底側壁部細胞膜に限局して局在した.GLUT5も最初はGLUT1と同様に細胞膜全周にわたって存在したが,頂部細胞膜により多く局在するようになった.一方SGLT1は最初は主に細胞内部に存在し,やがて培養液に接する細胞の頂部に陽性となった.今回の条件ではSGLT1はGLUT5とは異なり,細胞膜全周への局在はほとんど見られなかった.現在,頂部微絨毛を一ヵ所に集める作用のあるジャスプラキンを用いて頂部細胞膜を微絨毛とその他のミクロドメインに分けた場合の分布を,高解像の共焦点レーザー顕微鏡と電顕を使い検討中である.

糖の吸収供給機能を制御する糖輸送体の細胞膜ドメイン局在分布機構の分子形態学的解析

奨励研究(A)

研究期間:

1995年

鈴木健史

担当区分：研究代表者

本研究の目的は,糖輸送体分子の細胞内局在分布機構を解明することにある.このため,糖輸送体遺伝子を遺伝子工学的手法によって改変し,それを極性を持つ細胞に導入発現させ,発現した産物の挙動を高解像度蛍光抗体染色法,金コロイド標識法,レーザーコンフォーカル顕微鏡法等を組み合わせて観察した.その結果、正常なSGLT1は頂部膜ドメインに局在発現し,SMITは基底側壁部に局在発現した.SGLT1のN末部の30アミノ酸を除いた欠失遺伝子の産物は細胞膜全域に発現した.さらに,そのアミノ酸の代わりにSMITのN末部の10アミノ酸を加えたキメラ遺伝子産物は基底側壁部に局在発現した.この結果は,これらの糖輸送体の細胞内局在機構を規定するドメインがN末部の短いアミノ酸配列であることを示している.

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