共同研究・競争的資金等の研究課題 - 宇原　久

メラノーマにおける複数の変異遺伝子を候補とした個別化リキッドバイオプシー法の確立

基盤研究(C)

研究期間:

2022年04月

-

2025年03月

 

宇原 久

1細胞遺伝子発現解析によるメラノーマ細胞の増殖及び免疫関連分子間の関係性の解明

基盤研究(C)

研究期間:

2019年04月

-

2022年03月

 

宇原 久

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悪性黒色腫5例とメルケル細胞がん1例の手術検体について検討した。1例では、メラノーマ細胞は大きく5つのグループ（クラスター）に分けられ、２つのクラスターでは腫瘍細胞はMAPK系とHLAクラスIが高発現し、クラスIIとPD-L1の発現が少ないことを示している等の関係性が明らかになった。残りの５症例については細胞分離の段階で得られた細胞量が少ない、あるいはPCRの段階で次世代シークエンスに進める質が確保できず、微小ウエル内へのメラニン色素の沈降により酵素反応が進まない等の問題が発生した。フィルターなどを用いた対応を行ったが安定した手技が現時点では確率できていない。

美白化合物のメラノーマ細胞障害作用を利用した新規メラノーマ治療薬の開発

奨励研究

研究期間:

2019年

　

　

 

黄倉 真恵, 宇原 久, 肥田 時征

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BRAF遺伝子変異を有するメラノーマには分子標的薬が奏効するものの、のちに薬剤耐性が生じる場合が多い。本研究は、分子標的薬の耐性をアスコルビン酸、ロドデノールの併用で克服できるかどうかを検討した。結果、アスコルビン酸はBRAF/MEK阻害剤耐性メラノーマ細胞株SK-me1-23DT, ロドデノールはBRAF/MEK阻害剤耐性メラノーマ細胞株A375DTに強い細胞障害を誘発した。以上の結果から、アスコルビン酸とロドデノールは、分子標的薬(BRAF/MEK阻害薬)による耐性を克服しうる治療薬の候補となり得ることがわかった。

メラノーマ患者の血液循環腫瘍由来RNAを用いた病勢モニタリング法の確立

研究期間:

2016年

-

2018年

 

宇原久

担当区分： 研究代表者

血液循環腫瘍DNAを用いたメラノーマ患者の遺伝子解析

研究期間:

2014年

-

2016年

 

芦田敦子

EGFR阻害剤による皮脂腺細胞の変化と治療薬探索モデルの構築に関する研究

研究期間:

2013年

-

2015年

 

宇原久

担当区分： 研究代表者

リポソーム包埋インターフェロンβ遺伝子による進行期悪性黒色腫の遺伝子治療臨床研究

基盤研究(B)

研究期間:

2003年

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2006年

 

斎田 俊明, 松本 和彦, 宇原 久, 久保 仁美

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正電荷リポソーム内にインターフェロンβ遺伝子発現プラスミドを封入した製剤を悪性黒色腫の皮内・皮下転移巣へ局注し、有害反応の有無、安全性を評価するとともに、局所的・全身的効果を検討する第I/IIa相の臨床研究を実施した。当初の予定通りに、5症例への実施を終了した。対象症例は病期IVが4例、病期IIIが1例であった。これらの患者の皮膚転移巣に1転移巣あたりDNA量として径1cmまでのものには10ug、それ以上で径2cmまでのものには30ugのインターフェロンβ遺伝子を週3回、計6回局注した。径1cm以下の小型の転移巣が多発する場合には、各10ugの遺伝子を3個の転移巣へ注入した。総合的効果判定は、MR(mixed response)が1例、NC(no change)が1例、PD(progressive disease)が3例であった。MRの1例では遺伝子注入転移巣が完全消失したのみでなく、複数の非注入転移巣の退縮も認められた。しかし、他方で転移巣の新生がみられた。NCの1例は右下肢皮膚、右下大動脈周囲〜後腹膜腔リンパ節に転移を多発していたもので、右大腿の皮内転移巣への1回10ugのインターフェロンβ遺伝子の注入により、当該転移巣の増大が止まり、治療4週間後まで他の転移巣も増大を示さず、転移の新生もみられなかった。また、全例でとくに問題になる有害反応は認められず、本遺伝子治療の安全性が確認された。

CGH法による悪性黒色腫の早期病変における遺伝子変化の検索

奨励研究(A)

研究期間:

1997年

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1998年

 

宇原 久

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これまで新鮮凍結標本を用いて、研究方法の確立および結果の再現性について検討を行ってきた。(材料および方法)本邦人に発生し、かつ日光紫外線の関与が少ないタイプの悪性黒色腫原発巣10例(全てlevel III以上)、皮膚転移巣4例、リンパ節転移巣2例(計16例)、脂漏性角化症3例、ケラトアカントーマ3例の新鮮材料よりDNAを抽出後、Nick translation法でspectrumgreen-dUTPを用いて標識した。同様に正常人リンパ球から抽出したDNAをspectrumred-dUTPで標識した。DNAの純化後、Cot-1 DNAを加え、その後熱処理による変性を行った。常法通り作成し保存してある正常人末梢リンパ球染色体標本を熱変性後、脱水し、上記標識後の腫瘍細胞DNAおよび正常リンパ球DNAを標本上に乗せハイブリダイズを行った。DAPIによる染色体の対比染色を行った後に蛍光顕微鏡下でspectrumgreen、spectrumred、DAPIそれぞれの染色像を1検体当たり約20個の染色体標本についてCCDカメラでデジタルgray scaleイメージとして取り込み、それぞれに疑似カラーを与え重ねた後、3種の合成イメージを作った。合成色のシグナル強度をスキャンし欠失あるいは増幅している染色体部位を特定した(Cyto Vision A/W,APPLIED IMAGING社を使用)。(結果)解析が可能であった悪性黒色腫症例は16例中13検体で、2症例は原発巣と転移巣の比較が可能であった。1検体当たりの解析可能染色体標本数は8〜24個であった。原発巣におけるchromosomeimbalancesは欠失が染色体1,9,11,13-16,19,21に、増幅が10,15,16,21,22,XYを除く染色体にみられたが症例毎にかなりの多様性を示した。また、原発巣と転移巣間の比較では、両者間の染色体の変化は概ね一致しており、さらに1例は6q,8,14qに、もう1例は1p,4q,9pに転移後の変化がみられ、CGH法がこの種の比較に非常に有用であるとの印象を持った。現在、原発巣と転移巣の両者の病変を持つ症例を増やすと共に良性病変についても検討を進めている。

X染色体不活化の検出による皮膚前癌病変におけるクローナリティに関する研究

奨励研究(A)

研究期間:

1995年

　

　

 

宇原 久

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本研究は、1992年 Allenらによって明らかにされたアンドロゲン受容体遺伝子塩基配列をもとに、女性の約90%に保存されているCAG繰り返し配列部分をPCR法によって検出することにより、皮膚腫瘍において良性、境界型、悪性に分類されているものについてそのモノクローナリテイの有無を検出することにより、腫瘍細胞の単一性という面から再評価することを目的とする。 本年度はまず、安定した実験方法の確率をめざした.8例の女性メラノーマ患者より得られたホルマリン固定パラフィン包埋組織より腫瘍部分と非腫瘍部分を切り出しDNAを抽出後、サンプルの一部を制限酵素Hhalで処理した。次にアンドロゲン受容体遺伝子のCGA繰り返し配列部分をはさむ形で作成したプライマーを用いて、制限酵素処理後のサンプルと未処理のサンプルについてPCR法で増幅を試みた。 しかし、当初期待していた程度のDNAの増幅が得られなかった。 メラニンによる阻害作用あるいはサンプル内に混入しているポリメラーゼ阻害物質の存在が疑われたためキレートビーズなどによるサンプルの洗浄を行いインターナルコントロールの増幅は可能となったが、アンドロゲン受容体遺伝子の増幅が不良(8例中1例のみ増幅した)のため、さらにプライマー位置を変更し再度増幅を試みている。また増幅された1例のサンプルについてはプライマーの一方のみを標識しPCR法による増幅後ポリアクリルアミドゲル上での泳動を行っている。

各種皮膚疾患におけるエラスチンm-RNAのスプライシングの違いに関する研究

奨励研究(A)

研究期間:

1994年

　

　

 

宇原 久

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本年度は、(1)エラスチン代謝異状で疑われている皮膚疾患(弾力線維性仮性黄色腫.早老症など)及び(2)皮膚線維性腫瘍について、(1)病的な異状の有無(2)'良性悪性の鑑別点となるパターンが存在するか否かについて明らかにすることを目的とした。 まず生検材料、手術材料よりm-RNAを抽出し(腫瘍部or病変部、周辺正常部)C-DNAを合成後、エラスチン遺伝子の中のエクソン22,23,24,26A,32,33のスプライシングを検索するために設定したプライマーを用いて、PCR法を行った。電気泳動により、合成産物の塩基長の違い、パターン、特定バンドの消失の有無を調べた。本年度は、上記(1)に相当する患者がいなかったため、(2)については皮膚線維腫、持久性隆起性皮膚線維肉腫について検討した。その結果、両者側に今のところ明らかに有意と思われる違いを見い出すことはできないでいる。この点についてはさらに他のエクソンについての検討や、また点突然変異などの微小な変化の存在している可能性もあり、症例を増やすと共に上記の点について検討を進めている。