共同研究・競争的資金等の研究課題 - 市戸　義久

組織幹細胞を基盤とした、重症肝疾患治療用デザイナー細胞開発と再生機序の解析

基盤研究(C)

研究期間:

2023年04月

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2026年03月

 

市戸 義久, 三高 俊広

新生肝細胞創出による機能不全に陥った肝臓を蘇らせるための基礎的研究

基盤研究(B)

研究期間:

2018年04月

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2021年03月

 

三高 俊広, 谷水 直樹, 市戸 義久, 須藤 亮, 吉川 大和, 水口 徹, 深井 原

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成熟ラット肝臓から分離した肝前駆細胞である小型肝細胞の親細胞に当たるHPPCsがlaminin111依存性にintegrin beta1シグナルを介してself-renewal能を維持することを明らかにした。また成熟マウス肝臓から分離した小型肝細胞と胆管上皮細胞を共培養することにより、分化した肝細胞が形成する毛細胆管と胆管が結合した胆汁輸送系を有するhepato-biliary tubular organoidの作成に成功した。 移植した骨髄由来間葉系細胞が分泌する細胞外分泌顆粒中に含まれるmiR-146a-5pが内在性肝前駆細胞を活性化し増殖させることを明らかにした。

胆汁排泄路を有する肝組織モデルの作成

挑戦的研究(萌芽)

研究期間:

2017年06月

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2019年03月

 

三高 俊広, 谷水 直樹, 吉川 大和, 須藤 亮, 市戸 義久

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マウス肝細胞（または小型肝細胞）と胆管上皮細胞をコラーゲンゲル上で共培養し、Matrigel含有コラーゲンゲルを重層することで、毛細胆管と胆管が接続した胆汁排泄路を持つ類肝組織を形成する手法を開発した。 小型肝細胞の親細胞に相当するラット肝前駆細胞(Hepatocytic parental progenitor cells; HPPCs)はlaminin111依存性にIntegrin beta1シグナルを介してself-renewal能が維持され、不均等分裂により娘細胞を産生することを見出した。肝細胞をin vitroで増幅させる手法の開発に繋がる。

バンキング肝幹細胞の臨床応用に向けた橋渡し研究

基盤研究(C)

研究期間:

2017年04月

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2020年03月

 

水口 徹, 谷水 直樹, 三高 俊広, 石井 雅之, 市戸 義久

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肝再生移植のドナー細胞として肝幹細胞をCD45・TER119・CD31・EpCAM陰性、ICAM-1陽性細胞から分離する方法を確立。この細胞集団からは肝幹細胞のクローン細胞を樹立。また、Oncostatin Mで処理した細胞は、再生置換効率が改善。細胞採取効率を改善するために肝容積評価を対象となる25の研究を改めて検証。標準肝容積の算出法として3次元散布図に投影すると2つのクラスターに分類。肝親型前区細胞の自己再性能に関してラミニンの構造異形体の関与を明らかにした。ヒアルロン酸を基質にした場合、CD44陽性の小型肝細胞が増殖しマトリゲルを基質とした条件下において細胞回収率と再移植率が向上した。

細胞移植における免疫制御機構と肝再生促進機序の解析

基盤研究(C)

研究期間:

2017年04月

-

2020年03月

 

市戸 義久

担当区分： 研究代表者

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申請者はこれまでに、障害肝由来Thy1陽性間葉系細胞（Thy１）と骨髄由来間葉系細胞(BM-MCs)が分泌する細胞外小胞(Extracellular Vesicles: EVs)の中に、肝前駆細胞の増殖を促進する因子が含まれていることを見出した。今回、 Retrorsine/部分肝切除(Ret/PH)モデルにKupffer細胞活性を抑制する塩化ガドリニウム(Gd)を投与し、Thy1とBM-MCs移植によるSHPCsの挙動を検討した。結果、Gd投与によりThy1移植群ではSHPCsは縮小し、BM-MCs移植群ではSHPCsが増大した。このことから、Thy1移植群では移植早期のKupffer細胞の活性化が重要で、IL17RBシグナルを介してSHPCsの増殖を促進しているのに対し、BM-MCsではKupffer細胞は関与せず、BM-MCsが分泌する液性因子が直接SHPCsの増殖を促進している可能性が示唆された。そこで、EVsの中からBM-MCs特異的な因子の同定を試みた。miRNA マイクロアレイの解析結果から、6種を抽出し、次にRealtime PCRにて発現量を確認し、４種に絞った。この４種のmiRNAのmimicを、肝前駆細胞の１つである小型肝細胞(Small Hepatocytes; SH)に導入し、増殖能を検討し、1因子を同定した。今後は増殖シグナルの解析のほか、EVsに含まれるタンパク質をサイトカインアレイにて解析し、増殖促進因子の同定を行う予定である。

過冷却プログラム凍結したヒト肝幹細胞を利用した再生外科治療の橋渡し的基礎研究

基盤研究(C)

研究期間:

2014年04月

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2017年03月

 

水口 徹, 谷水 直樹, 平田 公一, 三高 俊広, 石井 雅之, 市戸 義久

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ヒト肝細胞の分離に際してドナー細胞採取に係る安全性の検討と手技の確立を企図した。安全かつ効率的なドナー採取の手技を確立しビデオも併せて報告した。ドナー細胞採取時の乳酸値の意義を明らかにした。術後の合併症に関して一定の基準を作成し提案した。ドナー採取におけるハーベスト方法に関して解剖学的領域による検討を行った。細胞の栄養バランスとしてBCAAの重要性に関して臨床的意義を明らかにした。肝幹細胞のバンク化を目指し、検体材料から細胞分離と細胞の性質を解析した。その過程で、継代可能な肝幹細胞の単離と培養に成功し、特許を出願した。肝再生置換療法のための肝幹細胞の抗原発現と細胞のセレクションを行った。

肝細胞機能を有するヒト肝前駆細胞株の樹立

挑戦的萌芽研究

研究期間:

2014年04月

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2016年03月

 

三高 俊広, 谷水 直樹, 市戸 義久, 水口 徹, 平田 公一

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継代培養可能な肝幹細胞株の樹立を試みた。成熟ラット肝臓から分離培養した小型肝細胞コロニーからCD44抗体を用いて分離したCD44陽性小型肝細胞をMatrigel上で培養すると増殖しコロニー形成する細胞が出現し、その細胞は4回以上継代可能で4ヵ月以上増殖し続けた。細胞はAlbumin, HNF4αを発現し、形態的にも機能的にも肝細胞としての特徴を維持していた。Retrorsine/PH処置マウスへ移植すると肝細胞として生着する。またマウス小型肝細胞株の樹立に成功した。今後は、ラット・マウスで用いた方法を応用してヒト肝幹細胞の樹立を目指し、臨床応用に繋げたい。

肝幹細胞移植による内在性肝前駆細胞増殖機構の解析

基盤研究(C)

研究期間:

2014年

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2016年

 

市戸 義久

担当区分： 研究代表者

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レトロルシン/部分肝切除(Ret/PH)モデルラット肝臓では, small hepatocyte-like progenitor cells (SHPCs)という肝前駆細胞が一過性に出現するが、その増殖機構は未解明である。障害肝由来Thy1陽性細胞をRet/PHモデルに移植すると、SHPCsが増大する。移植したThy１陽性細胞が細胞外小胞を分泌することで、類洞内皮細胞で Interleukin(IL)17Bを、Kupffer細胞でIL25を、SHPCsでIL17 receptor B(IL17rb)を誘導していた。IL17RBシグナル活性化により内在性肝前駆細胞の増殖が促進されたと考えられる。

肝不全治療のための肝幹・前駆細胞移植療法及び類肝組織を用いた人工肝臓モデルの開発

基盤研究(B)

研究期間:

2012年04月

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2015年03月

 

三高 俊広, 谷水 直樹, 市戸 義久, 水口 徹, 平田 公一, 須藤 亮, 吉川 大和

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我々は、Galactosamine投与肝障害早期に出現するThy1陽性細胞の一部は肝幹細胞であり、HGF/FGFによりCD44陽性肝前駆細胞を介して肝細胞へ分化するが、十分に成熟化できないことを明らかにした。Thy1陽性細胞や骨髄間葉系細胞の移植は、レシピエント肝の内在性肝前駆細胞の増殖を促進した。類洞内皮細胞やKupffer細胞の産生するIL17BやIL25がそれら前駆細胞の増殖を促進していた。胎生期の胆管形成にはlaminin alpha1鎖が、成熟化にはalpha5鎖が必要であり、胆管上皮細胞の分化可塑性は出生後すぐに消失し、Grhl2発現が胆管上皮細胞成熟化に重要であることが分かった。

肝小葉モデル型培養装置の開発

挑戦的萌芽研究

研究期間:

2012年04月

-

2014年03月

 

三高 俊広, 谷水 直樹, 須藤 亮, 市戸 義久

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シリコーン樹脂を用いて小型肝細胞と胆管上皮細胞の共培養用のデバイスを設計・作成した。酸素透過性があるシリコーン樹脂上では培養液のpH維持は良好であることを確認したが、培養皿上でデバイスを用いて流路毎の細胞基質の塗布と両細胞の接触培養法は確立できなかった。マイクロ流体デバイス内で肝細胞と血管内皮細胞を共培養すると内皮細胞はコラーゲンゲル中に毛細血管構造を形成し伸長することを明らかにした。マウス肝芽細胞株を用いて、胆管の管腔形成と維持にはLaminin511/522の存在が必須であり、転写因子のGrhl2がclaudin3/4の発現と局在調節を介して胆管の管腔形成を促進することを明らかにした。

組織幹細胞移植による肝再生機構の解析

若手研究(B)

研究期間:

2012年

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2013年

 

市戸 義久

担当区分： 研究代表者

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我々は肝幹・前駆細胞であるThy1陽性オーバル細胞はRetrorsine/部分肝切除モデルに対する移植実験で移植細胞巣をほとんど形成せず，置換効率が悪いため，肝疾患治療への応用は難しいという実験結果を得ていたが，更なる解析の結果，Thy1陽性細胞を移植すると移植早期で肝体重量比が増大するという結果を得た。そこで，レシピエント由来の肝前駆細胞(SHPCs)の出現率を解析したところ，1 mm2当たりのSHPCs clusterの数は移植していないcontrol群で0.37±0.06 個に対し，Thy1陽性細胞移植群では1.1±0.1 個，またSHPCs cluster構成細胞数はcontrol群で69.5±28個，Thy1陽性細胞移植群で130.4±70 個で，Thy1陽性細胞移植群で有意にSHPCs cluster数及び構成細胞数が多く，Thy1陽性細胞移植はレシピエント由来SHPCsの増殖を促進する，という知見が得られた。この現象をin vitroで再現し，増殖機構を解析するため，小型肝細胞とThy1陽性細胞を共培養した。Thy1陽性細胞由来の液性因子と細胞間接着の影響を検討するため，Cell strainerを介した間接共培養と直接共培養の２通りで検討した。controlとして小型肝細胞単独のものを用いた。結果，小型肝細胞コロニーの細胞数はcontrolで83.6±55.1，間接共培養で132.0±65.8，直接共培養で122.4±67.1であった。BrdU染色による labeling Indexでは，controlで22.8±8.9 %、間接共培養で44.5±14.1%，直接共培養で47.2±25.7%であり，間接共培養において有意に増殖能が高まったことから，Thy1陽性細胞由来の液性因子が，内在性SHPCs増殖促進のKey factorになっていることが示唆された。

肝幹細胞活性化機構の解明と肝組織工学への応用

若手研究(B)

研究期間:

2010年

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2011年

 

市戸 義久

担当区分： 研究代表者

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肝前駆細胞としてoval細胞と小型肝細胞が知られている。我々はこれまでにThy1陽性oval細胞の一部がCD44陽性の小型肝細胞を介して肝細胞へ分化することを報告してきたが,詳細はわかっていない。本研究の結果,(1)未分化Thy1陽性oval細胞の小型肝細胞への分化誘導因子として, EGF, bFGF, HGFがKeyとなる誘導因子であった。(2) Thy1陽性細胞とCD44陽性細胞は肝細胞には分化するが,成熟化までは至らなかった。(3) Thy1陽性細胞とCD44陽性細胞,そして正常成熟肝細胞の移植実験における肝細胞置換能を比較検討したところ, Thy1陽性細胞とCD44陽性細胞の生存率は低かった。この生存率は細胞老化によるものと考えられた。

ヒト肝細胞増産と肝組織移植を目指した基礎的研究

基盤研究(B)

研究期間:

2009年

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2011年

 

三高 俊広, 谷水 直樹, 大栄 秀和, 市戸 義久, 水口 徹, 平田 公一, 吉川 大和, 谷下 一夫

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肝前駆細胞である小型肝細胞を増産する手法の開発とin vitroにおける肝組織化とその移植方法の確立を目的に研究を行った。小型肝細胞は成熟肝細胞とは異なりFollistatin/Activin系により増殖が制御されていることがわかった。幹細胞であるOval細胞は小型肝細胞を介して肝細胞に分化するが、十分に成熟化することはできず、移植しても長期間生着し続けることはできず細胞老化に陥る。その結果は、肝幹・前駆細胞は一時的に肝機能を補助する細胞としての働きをしていることを示唆する。また、小型肝細胞、星細胞、血管内皮細胞を用いた類洞再構築モデルを確立し、星細胞が血管構築と肝細胞分化を制御していることを明らかにした。

小型肝細胞と骨髄間葉系幹細胞との共培養によるミニ肝組織構築及びその形成機序の解明

特別研究促進費, 基盤研究(C)

研究期間:

2007年

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2008年

 

市戸 義久

担当区分： 研究代表者

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肝臓を生体外で再構築ためには,増殖・分化ポテンシャルの高い細胞を用い,3次元構造を形成させることで肝機能を発揮させる必要がある。そこで本研究では,(1)増殖・分化ポテンシャルの高い細胞として,小型肝細胞と骨髄間葉系幹細胞との共培養,(2)3次元構造を形成させるための細胞外環境の付与,を組み合わせることで,立体的なミニ肝組織の構築及びその形成機序の解明を目的とした。本研究により,患者の肝組織より小型肝細胞を分離培養し,同患者から採取した骨髄間葉系幹細胞を共培養,増殖させることで細胞数の確保とその増幅に限界があった小型肝細胞の臨床応用の可能性が高まると考えられる。

ヒト肝幹細胞を用いた類肝組織形成とその類肝組織を組み込んだ人工肝臓モデルの研究

基盤研究(B)

研究期間:

2005年

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2007年

 

三高 俊広, 吉川 大和, 今 純子, 市戸 義久, 水口 徹, 平田 公一

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ラット小型肝細胞特異的遺伝子としてCD44を同定し、障害肝においてCD44陽性細胞が一時的に出現すること、抗体で分離し培養したCD44陽性細胞は小型肝細胞と同様の表現型を持ち、肝細胞へ分化することを見出した(J Hepatol,2006)。ガラクトサミン誘導肝障害時に出現ずるThy1陽性細胞の一部はCD44陽性小型肝細胞に分化することを見出した(論文投稿中)。CD44陽性細胞をRetrorsine/PH処置ラット肝に移植すると生着し、増殖して肝細胞へ分化した。培養し増やした小型肝細胞を放射線照射/PHしたラットに移植しても生着し、レシピエント肝細胞と置換し増殖することを見出した(Liver Transplant,2005)。CD44のリガンドであるヒアルロン酸と無血清培養液を用いると小型肝細胞を選択的に増殖させることができ(Nature Protocols,2007)、この方法を用いるとヒト小型肝細胞を分離培養できること、ヒト小型肝細胞は3週間で約100倍増殖することを見出した(論文投稿中)。小型肝細胞は、Follistatinを分泌することによりActivin A作用を阻害し、増殖することを見出した。また正常ヒト肝組織より分離したヒト小型肝細胞分画の細胞をコラーゲンスポンジ内で培養することにより、肝細胞と胆管上皮細胞からなる類肝組織を形成させることができた(Tissue Engineering,2005)。ポリカーボネート多孔性膜上でラット小型肝細胞を培養したものを2枚、細胞が接するように積層することにより、3次元積層類肝組織を構築させることに成功した(FASEB J,2005)。成熟ラット肝臓から分離た胆管上皮細胞を分離培養し、コラーゲンゲル内で胆管を再構築することに成功した(Am J Pathol,inpress,2008)。