Research Projects -
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Investigation of causative gene of familial occurrence of idiopathic occlusion of Willis ring
Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
Project Year :
2002-2004HOUKIN Kiyohiro, TOKINO Takashi, TADA Mitsuhiro
View Summary
Purpose and Background: It is estimated that some genetic factors are closely related to the familial moyamoya disease. Previous microsatellite analysis has suggested that related genes may be located on chromosomes 3,8,12 and 17. However, the responsible gene has not been identified yet. This study aimed to identify the responsible genes that are located in the 17825 locus. In addition, clinical anticipation and the presence of triplet repeat was investigated and the basic FGF and HGF of the cerebrospinal fluid of moyamoya patients were measured. Methods and Results: Considering the function, we selected nine genes as candidates from a total of 65 genes identified in the 9-cM region of D17S785-D17S836 in chromosome 17825, and performed sequence analysis on the DNA samples obtained from a pedigree of familial moyamoya disease, which showed a complete linkage to the region by a haplotype analysis. Also, we attempted to identify candidate genes that have not been known but might be functionally relevant to the disease among a total of 2,100 expressed sequence tag (EST) sequences using bioinformatics techniques. As results, the sequence analysis could detect no mutation in the nine genes. Nor could we identify a novel candidate gene by the EST analysis. Clinical anticipation study was done based on 141 cases with moyamoya disease. This analysis revealed that apparent clinical anticipation was observed in familial moyamoya disease. No triplet repeat was found in 17g25 locus. Cerebrospinal fluid was obtained from the patients during surgery. Control value was measured using asymptomatic cerebral aneurysm patients and other ischemic cerebrovascular disease. As results, high value of basic FGF and HGF was seen in the cerebrospinal fluid of moyamoya patients compared to the control group. Conclusions: Clinical anticipation observed in familial moyamoya patients suggests that some triplet repeat may located in some gene in moyamoya disease. Further studies using alternative approaches are warranted to clarify the pathogenesis of moyamoya disease. However, our results of high level of some cytokines including basicFGF and HGF suggests that some gene abnormality related to these cytokines are closely involved the pathogenesis of moyamoya disease.
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転写制御因子p63の発生,分化における役割
特定領域研究
Project Year :
2002-2003佐々木 泰史, 時野 隆至
View Summary
1.正常の発生段階あるいは細胞分化においてp53ファミリーメンバーの機能を媒介し直接実行する標的遺伝子を決定するために,p53ファミリーをいくつかのヒト癌細胞株に導入し、cDNA microarrayによる発現解析を行った.その結果,p73の特異的標的遺伝子としてIL-4Rα遺伝子を同定した.さらにIL-4Rαゲノムにp73タンパクと細胞内で特異的に結合する部位を同定し,p73がこの配列に結合することによりコファクターがリクルートされ,ヒストンのアセチル化が促進されることを明らかにした.またp73が活性化した細胞をIL-4で刺激すると,STAT6の活性化とアポトーシスが誘導され,この効果はIL-4Rの中和抗体により抑制された.この結果はp73がIL-4シグナルを介して細胞の分化,炎症,アレルギーに関わっていることを示唆している. 2.p53ファミリー共通の標的遺伝子としてosteopontin(OPN)を同定した.OPNは主に活性化T細胞から分泌されるサイトカインで,骨組織の形成に不可欠だけでなく,B細胞の分化増殖や抗体産生能に重要な役割を果たしていることが示された.この結果はp53ファミリーの機能に関する新しい知見と考えられる. 3.p53ファミリーにおいて最も最も高親和性で結合するDNA配列には違いがあり,スペイサーが介在するp53結合モチーフ配列RRRCWWGYYYの3コピー以上で構成される配列が,p63あるいはp73の高親和性応答配列として働くことが示唆された.従ってp53ファミリーは結合配列に対する親和性の違いにより標的遺伝子の使い分けをしており,生体においては単純に機能が重複している遺伝子ファミリーではないことを明らかにした.
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Function of p53 and its target genes
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
Project Year :
2000-2004TOKINO Takashi
View Summary
1. Novel p53-target genes : Tumor suppressor p53 is a transcription factor that induces growth arrest and/or apoptosis in response to cellular stress. To identify novel p53-inducible genes, we compared the expression of genes in normal mouse embryo fibroblasts to p53-null cells by cDNA representational difference analysis (RDA). We have identified that expression of endogenous SCN3B (sodium channel subunit beta 3) and OPN (osteopontin) are upregulated in mouse embryonic fibroblasts by DNA damage in a p53-dependent manner. The p53-directed regulation of OPN expression suggests a novel model of p53 participation in immunosurveillance, involving interaction with the host immune system to prevent damaged cells from undergoing malignant transformation. The results presented above also suggest that SCN3B mediates a p53-dependent apoptotic pathway and may be a candidate for gene therapy combined with anticancer drugs. 2. Biological functions of the p53 family member genes : p63 and p73 were recently identified as members of the p53 gene family. In contrast to p53 however, p63 and p73 are rarely mutated in human cancers. To determine how p63 and p73 are involved in carcinogenesis and normal development, we attempted to identify target genes that are specifically regulated by p63 and/or p73 but not p53. We identified the JAG1 and JAG2 genes, encoding ligands for the Notch receptors, and the PEDF gene are direct target of p63 and p73. We also found that IL4 receptor alpha is upregulated by p73. These findings show an association between the p53 family genes and Notch signaling and suggest a potential molecular mechanism for the involvement of the p53 family genes in normal development. Our data also suggest that IL-4Ralpha could mediate, in part, certain immune responses and p73-dependent cell death. 3. Adenovirus-mediated transfer of the p53 family genes, p73 and p63 induces cell cycle arrest and apoptosis in human cancer cell lines : p53 gene therapy is being tested clinically for the treatment of human cancer, however, some cancer models (in vivo and in vitro) are resistant to p53. To explore the potential use of two p53 homologues, p73 and p63, in cancer gene therapy, we introduced p53, p73 and p63 into colorectal cancer cell lines via adenoviral vectors, and compared their effects on cell growth. Among 10 cell lines tested, six cell lines displayed a similar response following transduction of p53, p73beta or p63gamma ; two lines underwent cell-cycle arrest, three lines exhibited apoptosis and one line showed no-effect following transduction. The effect on cell-cycle progression was variable in the other four cell lines. Interestingly, three cell lines were resistant to p53-mediated apoptosis, including two lines having endogenous wild-type p53 alleles, but underwent apoptosis after transduction of p73beta or p63gamma. Transduction of p73beta and p63gamma also reduced the tumorigenicity of two colorectal cancer cells in vivo. These results suggest that adenovirus-mediated p73beta and p63gamma transfer are potential novel approaches for the treatment of human cancers, particularly for tumors that are resistant to p53 gene therapy.
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Genetic analyses for DNA replication error, beta-catenin gene, SKT11 etc.among the patients with gynecologic cancer
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
Project Year :
1999-2001SAGAE Satoru, KUDO Ryuichi, TOKINO Takashi, ISHIOKA Shinichi
View Summary
The recent studies showed that the RER abnormalities were detected in 23 % for endometrial cancer and 3 % of ovarian cancer, which genetic changes were detected in only endometrioid type of cancer. The prognosis of RER positive patients (pts) with endometrial caner tended to be worse and among them a case with MMR gene mutation (hMLH1 etc) was detected. The mutation of beta-catenin gene were detected in 5 cases (8 %) of 61 ovarian cancer pts and 5 cases (14 %) of 35 endometrial cancer pts, and a micro metastasis of pelvic lymph node had a mutaton of beta-catenin gene,which might be useful for molecular diagnosis of lymph node metastasis. The putative SKT11 gene, which function is Serine/Threonine Kinase, was reported as causative gene of Peutz-Jegher Syndrome. We performed the mutational analysis of STK11 gene in 30 ovarian cancer pts by SSCP-Sequence method. Only one case showed its mutation of CCG-CTG(Pro281-Leu)at exon 6 and two cases showed extra bands at exon 5. A new anticancer drug group, Taxanes (Paclitaxel or Decetaxel) has been introduced for the treatment of ovarian cancer. However, chemosensitivities of these drugs are not determined before treatment of ovarian cancer. We tried to find out the possibilities of early detection of chemosensitivity by using genetic alteration, such as p53, BAX, Bcl-2 etc, and to analyze the mechanism of drug resistance. We showed that Paclitaxel-induced apoptosis played important roles of two different signal transductions, such as p53 independent pathway and stress-induced pathway in ovarian cancer cell lines, Blocking of these pathways and overexpression of bag-1 or hsp70 might be essential for the acquired resistance for Paclitaxel.
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ヨーロッパなどががん研究先進国との研究交流
特定領域研究(A)
Project Year :
1999黒木 登志夫, 石川 冬木, 樋野 興夫, 菊池 章, 開 祐司, 宮園 浩平, 佐谷 秀行, 貝淵 弘三, 山本 雅, 時野 隆至, 秋山 徹, 高橋 雅英, 田中 信之, 武藤 誠, 堀井 明
View Summary
1.研究背景: がん遺伝子の発見をきっかけに、がん研究は遺伝子の時代に入り、欧米のがん研究先進国を中心に激しい研究競争を繰り広げている。地理的に隔離されているわが国の研究者は、研究者との直接の討論、情報、資料交換に自ら制限があり、ともすると孤立しかねない。この問題点を克服するため、わが国の第一線の研究者を積極的にがん研究先進国に送る必要がある。本研究は、ヨーロッパのがん研究先進諸国との研究交流を目的に組織された。特に、日独、日仏がんワークショップはそれぞれ一年毎にヨーロッパ本国と日本と場所をかえて行われているが、本年度は日独をヨーロッパで、日仏を日本で開催した。本年度は10名をヨーロッパ諸国に派遣した。 2.日独がん研究連絡会議: 1999年7月29〜31日独国・エッセン、エッセン大学において「分子細胞生物学的がん研究」に関する日独がんワークショップを開催した。わが国から黒木登志夫(昭和大・腫瘍分子研)、秋山 徹(東大・分生研)、菊池 章(広島大・医)、樋野興夫(癌研)、石川冬木(東工大・生命理工学)が本研究費で出席した。 3.日仏がん研究連絡会議: 1999年9月8〜10日、東北大学・医学部において、「21世紀のがん研究に向けての新しい戦略」をテーマに日仏ワークショップが開催された。フランス側から12名、わが国からは黒木登志夫(昭和大・腫瘍分子研)、石川冬木(東工大・生命理工学)、宮園浩平(癌研)、広橋説御、塚田俊彦、落合孝広(国立がんセ・研)、渋谷正史、中村祐輔(東大・医科研)、中山敬一(九大・生医研)、月田承一郎、武田俊一(京大・医)、伊藤嘉明(京大・ウイルス研)、菅野晴夫(癌研)、豊島久真男(住友病院)が本研究費で出席した。 4.その他の派遣者: 宮園浩平(癌研)、藤井穂高(東大・医)、丸義朗(東大・医科研)、開祐司(京大・再生医研)、千葉英樹(札幌医大・医)をヨーロッパの先進研究室に派遣した。
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罹患同胞対法を用いた胃がん関連遺伝子の解明
特定領域研究(A)
Project Year :
1999笹月 健彦, 松野 正紀, 横田 淳, 伊東 文生, 磨伊 正義, 三輪 晃一, 時野 隆至
View Summary
胃がんの発症に寄与するがん関連遺伝子の単離を目的として、胃がん罹患同胞対検体収集、若年発症弧発胃がん症例検体の収集を継続し、罹患同胞対法による全ゲノムスキャニングを行った。 1.17施設の臨床グループにより、胃がん同胞発症対から、インフォームド・コンセントに基づいて採血を行い、DNAの抽出・保存を行った。これまでに70組の同胞対検体が収集された。 2.上記の胃がん同胞発症対57組に対して、4施設の解析グループにより400個のマイクロサテライトマーカーを用いたDNA多型解析を行った。MAPMAKER/SIBのプログラムを用いた連鎖解析を、全染色体について終了した。第1、8、9、11、21染色体において1.0以上のLOD値を示す領域を見出した。 3.健常対対照群326人のDNAを利用して、日本人集団における各マーカーのアリル同定の作業を4施設の解析グループにより完了した。 4.若年胃がん発症例(弧発例)の末梢血の採取を開始し、これまでに100人(発症時平均年齢41.6歳)のDNAが抽出・保存された。 これまでの57組を対象とした解析において、1以上のLOD値を示す上記染色体が同定されたことは注目に値する。解析数を増やすこと、若年発症弧発例を用いて解析すること等により胃がん発症との関連を確認する。
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Functional analysis of p53-target genes.
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
Project Year :
1999TOKINO Takashi
View Summary
We isolated p53-binding sites by genetic approach in yeast and then identified novel p53-target genes. One of these, called BAl1 , which was expressed in brain and repressed in 8/9 glioblastomas, was further characterized to inhibit neovascularization in the rat cornea by basic FGF.To investigate the in vivo anti-angiogenic effect of BAl1 gene on a human glioblastoma cell line, p53-defective human glioblastoma cells U373MG were transduced with the BAl1 gene using a recombinant adenoviral vector. In vivo neovascularization assay of the BAl1-infected glioblastoma cells was then performed using skinfold chamber system transplanted in SCID mice and revealed that BAl1 transduction resulted in reduced neovascurization in SCID mice. Expression of the glycosyl-phosphatidylinositol-anchored molecule-like protein (GML) gene, another p53 target, correlates with the sensitivity of some cancer cell lines to anticancer drugs and ionizing radiation. To investigate the function of GML further, we introduced the GML cDNA into various cancer cell lines under control of the tetracycline-regulated system. When we introduced GML into human glioblastoma cell line T98G, which lacks wild-type p53 and expresses no endogenous GML, we observed significant growth suppression accompanied by G2/M arrest in two independent, stable cell lines. We confirmed introduction of apoptosis by fluorescence-activated cell sorting (FACS) analysis and nuclear staining. Our results indicated that GML could induce apoptosis of T98G without functional p53, and implied that GML plays a crucial role in the apoptosis pathway in some cancer cells.
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BAI1 expression in human glioma
Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
Project Year :
1998-1999ARITA Norio, NAKANO Atsuhisa, MATSUMOTO Tsuyoshi, KABA Keizo, TOKINO Takashi
View Summary
BAI1, brain angiogenesis inhibitor 1, was originally isolated as a p53-target gene. BAI1 gene has a p53-binding sequence, and it was directly induced by wild-type p53. BAI1 protein has thrombospondin type 1 repeats which inhibit angiogenesis. In human gliomas, p53 mutation has been frequently observed. It might be possible that in gliomas with mutant p53, BAI1 expression reduced resulting in increased angiogenesis and enhanced tumor growth. We examined relationship between BAI1 expression, p53 mutation and aniogenesis using human glioma tissues. 〔Materials and methods〕 Using human glioma tissues obtained by surgery, (1) expression of the BAI1 gene, (2) mutation of the p53 gene, (3) correlation between BAI1 expression and p53 mutation, and (4) correlation between BAI1 expression and angiogenesis were studied. 〔Results〕 (1) BAI1 mRNA was semiquantitatively assayed by RT-PCR. Compared with that of normal brain tissue, it was reduced in 70% of the glioma examined. BAI1 expression was more frequently reduced in high grade gliomas. (2) Mutation of the p53 gene was analyzed by PCR-SSCP. P53 gene was mutated in 30% of the glioma. These mutation occurred in the locus affecting the transcription regulating capacity of the p53 gene. (3)No significant correlation was found between BAI1 expression and p53 mutation. (4) Glioma tissues were immunostained by an anti -CD34 antibody to examine the density of the tumor vessel. In the glioma in which BAI1 expression was reduced, number of the tumor vessels was increased as compared that of the glioma with normal BAI1 expression. 〔Discussion〕 These results indicate that in some glioma, BAI1 expression might be reduced by other factors than p53 mution. BAI1 protein overproduction by BAI1 gene transfer may inhibit angiogenesis in glioma with reduced BAI1 expression. In T98G and U87MG glioma cell lines, BAI1 gene is now tried to be transferred using Tet-On system to investigate how inhibition of the angiogenesis may influence on the glioma cell growth in vivo.
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Positional cloning of carnitine trasporter gene and its comtribution to the pathophysiological changes
Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
Project Year :
1996-1997KUWAJIMA Masamichi, TOKINO Takashi, MURAKAMI Takashi, NOMA Yoshihiko
View Summary
The exact roles playd by carnitine in vivo have remained unclear. Our recent discovery of mice with systemic carnitine dificiency (JVS mice) offers the possibility of improvement of this circumstance. These JVS mice show symptoms such as fatty liver, hyperammonemia, hypoglycemia, cardiomegaly and skeletal muscle degeneration. We have been analyzin the histological, biochemical and molecular biological features of tissues from various sites of their bodies, focusing on the analysis of the relationship between carnitine deficiency and the diverse symptoms exhibited by these mice. We have obtained the following findings : 1. As early as 2 weeks of age, JVS mice had higher absolute heart weights and higher retios of heart weight to body weight than controle mice. Hypertrophy of my ocardial cells was seen, and the nuclei of these cells tended to be larger in JVS mice. When observed under an electron microscope, the nuclei were slightly hypertrophic and not a few cells showed marked increase in mitochondria. The levels of carnitine palmitoyl transferase I (CPTI) mRNA and CPT II mRNA differted from those in controle mice. 2. High-affinity carnitine transport activity was absent in the fibroblasts of JVS mice. This indicates that JVS mice can serve as an animal model of human primary carnitine dificiency. 3. The symptoms seen in JVS mice are genetically transmitted in an autosomal recessive manner. It is thougt that a single gene is responsible for all these symptoms. The JVS gene was located on chromosome 11.
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癌抑制遺伝子の単離とそのヒト癌における遺伝子異常の解明
重点領域研究
Project Year :
1995時野 隆至, 中村 祐輔, 江見 充, 藤原 義之
View Summary
32人の食道癌患者の種々の段階の106病変(異形成・早期癌・進行癌)における遺伝子異常を、マイクロサテライトマーカーを利用した染色体欠失を指標として解析し、3p,17pの癌抑制遺伝子の不活性化が異形成の段階ですでに起こっていることや9p,9qの癌抑制遺伝子の不活性化は癌化の段階で重要な役割をしていることなど、食道癌においても多段階的に遺伝子異常が蓄積されていることを明らかにした。また、種々の臓器の扁平上皮癌の発生に共通して関与していると考えられる第9染色体長腕の遺伝子については、数百kbの範囲まで癌抑制遺伝子の存在部位を限局化することができた。遺伝性癌の原因遺伝子のひとつであるMLH1遺伝子の変異を効率よく検索し発症前診断に応用するために、この遺伝子の全エキソンを1枚のゲルで解析するスクリーニング法を確立した。この方法によって全エキソンの変異の有無の検索を24時間以内に行うことが可能となった。さらに、リンパ節転移の有無を原発巣において認められる遺伝子異常を指標として遺伝子レベルで診断することの臨床的意義を調べるため、120例の病理組織学的にリンパ節転移陰性と診断された大腸癌患者についてレトロスペクティブに検討を行った。その結果、遺伝子診断はより正確な予後判定指標であり、術後の化学療法の適否を判断するための有用な指標になりうることが示唆された。また、抗p53抗体による免疫組織学的な検討の結果と遺伝子診断の結果との対比から、MASA法による解析によって生きた癌細胞のみならず、免疫細胞に呑食された癌細胞をも検出可能であることが示唆された。次に、p53蛋白の結合すると考えられるDNA断片を有するコスミドクローンを単離し、それらをもとに正常p53蛋白によって発現が誘導される2種類の新規の遺伝子の単離に成功した。
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がんの遺伝子診断
重点領域研究
Project Year :
1994-1996珠玖 洋, 安井 弥, 高橋 隆, 森下 和廣, 時野 隆至, 金子 安比古, 谷口 直之
View Summary
1.胃癌組織40例において、CDC25Aは45%、CDC25Bは70%(28症例)において発現増強が認められ、CDC25Cは全てで低発現だった。CDC25Bは低分化腺癌症例、ステージの進んだ症例に発現増強が認められた。又、分子病理診断の一つとしてCAr ep eatを2ローカス、polyAを2ローカス検討し、約5%の症例でreplication errorを同定した。分子病理診断は9000例にいたった。 2.208症例の非小細胞癌症例でcyclinD1およびRb遺伝子の検討を行ったところ、cyclinD1遺伝子発現の消失がみられた腺癌症例は、有意に短い術後生存期間を示した。多変量解析でもcyclinD1はp53、病期と共に独立した有意な予後因子だった。 3.神経芽腫106例を対象として、1p36のD1Z1と1q12のD1Z1プローブを用いてFISH法で検討した。D1Z1の数(n数)、およびD1Z1数に比してのD1Z2数(D1Z1>D1Z2;b;D1Z1=D1Z2;a)更に、RFLPマーカーによる1pのLCH、及びN-myc増幅を合わせて検討した。その結果、2nb、4nb腫瘍は予後不良、3n、5n腫瘍は予後良好、2na、4na腫瘍はその中間であった。 4.急性骨髄性白血病における第三染色体の異常をEVI1遺伝子を中心として解析した。t(3;7)転座を有する症例、t(1;3)転座を有する症例の切断点および遺伝子を同定した。又40症例の白血病においてガングリオシドGM3からのGD3の合成酵素、α2,8シアル酸糖転移酵素の発現を検討したところ、T-ALLで中等度の、ATLで高い遺伝子発現が認められた。 5.p53の下流標的遺伝子の検索を進め、8種類の正常型p53により発現制御される遺伝子を同定した。そのひとつはGPl anchor ed mol eculeに属する新しい遺伝子であり、その発現は食道癌細胞株の抗癌剤感受性と強い相関性を示した。 6.AFPやγ-GTPの糖鎖に癌性変化を起こすα1,6 fucosyltr ansfer aseの精製を行いそのcDNAを単離した。
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癌抑制遺伝子解析のためのヒト第3染色体遺伝的地図の作成および遺伝子の同定
一般研究(A)
Project Year :
1990-1991中村 祐輔, 土屋 永寿, 北川 知行, 時野 隆至, 佐藤 孝明
View Summary
癌における癌抑制遺伝子の異常は一般的に一方の染色体側の欠失と他方の染色体側の小さな変異(点変異や小さいDNA断片の挿入・欠失)として認められる。したがって、対象とする腫瘍組織において欠失している染色体部位を詳細に検討することにより、その腫瘍の発生に関与する癌抑制遺伝子の存在する位置を同定することが可能である。われわれは肺の非小細胞癌の発生に関わる癌抑制遺伝子を単離することを目的として49例の腺癌・18例の扁平上皮癌におけるヒト第3染色体短腕領域の欠失について、19のRFLPマ-カ-を利用して調べた。この結果、49例の腺癌のうち33例(67%)がこの染色体の欠失を起こしていたことが明かとなった。また、比較的多くの症例がこの染色体の一部分だけを欠失していることがわかった。さらに複数の腫瘍に共通して欠失している領域は3p21.3と3p14.1ー21.1の2領域であることが同定され、第3染色体上には肺の腺癌の発生に関与する癌抑制遺伝子は少なくとも2個存在すると推測される。さらに、染色体欠失の頻度とステ-ジを比較したところ、ステ-ジ1・2では30例中17例が欠失していた(57%)のに対し、ステ-ジ3では19例中16例(84%)の高頻度の欠失を認めた。また、病理学的分化度との対比では高分分子化癌では22例中12例(55%)の欠失頻度であったのに対し、未分化癌では7例中7例とも欠失していた。このことから、第3染色体上の癌抑制遺伝子の異常は肺腺癌の増悪因子としてとらえられるのではと考察される。また、扁平上皮癌では18例すべてにおいて、第3染色体短腕の欠失を認め、欠失領域も腺癌と比べて大きな領域であった。したがって、どの染色体の部位に問題となる遺伝子が存在するかを特定することはできなかった。今後は、さらに用いるRFLPマ-カ-の数を増やして、多数のサンプルを調べ、遺伝子の単離を目指したい。
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DNA増幅法(PCR法)による高多型VNTRマ-カ-の単離
一般研究(C)
Project Year :
1990-1991時野 隆至
View Summary
最近、多用されているミクロサテライトDNAの多型を効率よく同定する方法をテストした。ヒトゲノムコスミドライブラリ-に対してオリゴヌクレオチドCACACACACACACACACACAを用いてスクリ-ニングしたところ、約40%のクロ-ンが陽性であった。ミクロサテライト多型はくり返し配列の両側の配列を決定し、この配列からプライマ-を設計してPCR法(Polymerase Chain Reaction法)によりヒトゲノムDNAを増幅し、アクリルアミドゲル電気泳動によって長さに従ってDNAを分離することによって同定される。この際、最も労費を要するのはくり返し配列両側のDNAの配列を決定することである。そこでこのステップを簡便化するためにCAを10回くり返したオリゴヌクレオチドの3'側にA,GあるいはTを加えたもの、CC、CT、もしくはCGを加えたものの6種類のプライマ-をミックスしたものを直接コスミドのDNA配列を決定するプライマ-として用いた。この結果、約30%のクロ-ンがこれで直接配列を決定することが可能であった。3種類ずつにしたものでは約70%のクロ-ンがシ-クエンス可能であった。今後、この方法を利用してCAのくり返しによる多型を同定していくことが可能であると考える。
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乳癌・大腸癌における癌抑制遺伝子の単離
がん特別研究
Project Year :
1990中村 祐輔, 三木 義男, 西庄 勇, 時野 隆至, 佐藤 孝明
View Summary
乳癌に関しては200例の乳癌患者の正常および癌組織よりDNAを抽出し、RFLPマ-カ-による染色体の欠失を調べた。全染色体にわたる40個のRFLPマ-カ-によって検索した結果、第3染色体(45%)、第13染色体長腕(28%)、第16染色体長腕(46%)、第17染色体短腕(57%)、第17染色体長腕(38%)に高頻度の欠失を認めたことから、これらの部位に癌抑制遺伝子の存在することが示唆された。また、erbB2遺伝子領域の増幅と第17染色体短腕の欠失との間強い相関(p<0.001)が認められたことから染色体の異常は独立しておこるのではなく、ひとつの異常が他の異常を起こし易くする可能性が考えられた。また、第13染色体の欠失も第17染色体の欠失が影響している可能性が示されるとともに、この染色体上の癌抑制遺伝子の欠失が、癌の増悪に関係することが病理学的な診断との比較により示唆された。また、それぞれの染色体における共通欠失領域の同定も行い、第3・16・17染色体については5〜10cMの領域に癌抑制遺伝子の存在部位を限定している。大腸癌については、第5染色体の家族性大腸腺腫症の原因遺伝子の検索を中心に研究を行った。一人の患者からの複数個の腺腫と癌における染色体欠失を調べたところすべての腫瘍が同一領域を欠失していたことから染色体欠失はランダムに起きるのではなく特別なメカニズムによって起こっていることが示唆された。さらに、家族性大腸腺腫症患者において同定した200kbの欠失領域近傍より単離した3種類のcDNAのひとつが大腸癌において欠損あるいはアミノ酸置換をおこす点変異を起こしていることが明かとなった。この遺伝子はG蛋白活性化ドメインと考えられる領域を有し、大腸癌の発生に関与する癌抑制遺伝子であり、MCC(Mutated in colorectal carcinoma)遺伝子と名付けた。