研究者詳細 - 時野　隆至

共同研究・競争的資金等の研究課題 - 時野　隆至

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新規がん治療法の開発をめざしたp53との合成致死に関与する遺伝子群の探索

基盤研究(C)

研究期間:

2022年04月

2025年03月

時野隆至

p53経路の破綻による腫瘍悪性化の解明と分子標的治療への応用

基盤研究(C)

研究期間:

2019年04月

2023年03月

時野隆至

p53はヒト悪性腫瘍で最も高頻度に変異している遺伝子であるが，「がん抑制遺伝子」であるためp53経路をターゲットとした抗がん剤の開発は遅れている．そのためp53転写ネットワークの全貌を解明することは，がんゲノム情報にもとづいたがん治療に有望な分子標的治療薬の開発につながることが期待できる．本年度は，p53の活性化に関与する長鎖非コードRNA (long non-coding RNA; lncRNA) を探索した．本研究では，TCGA (The Cancer Genome Atlas)のがんゲノムデータを利用して，正常大腸上皮細胞と比較して大腸がん細胞で高発現し，かつ高発現群で予後不良と相関するlncRNAを10個同定した．このうちの1つのlncRNAに注目し，正常型p53遺伝子をもつ大腸がん細胞株HCT116(p53+/+)においてこのlncRNAをノックダウンし，次にRNAシーケンス (RNA-seq) により発現変動遺伝子を網羅的に解析した．その結果，コントロールHCT116(p53+/+)細胞と比較してこのlncRNAノックダウンHCT116(p53+/+)細胞で，p53の代表的標的遺伝子遺伝子CDKN1A（p21タンパク質をコード）の発現が最も有意に上昇していた．そこで，第16番染色体に位置するこの長鎖非コードRNAをlnc53AC（仮称）と名付けた．p53遺伝子をノックアウトしたHCT116(p53-/-)細胞ではCDKN1A遺伝子の発現上昇は見られず，lnc53ACはp53依存的にCDKN1A遺伝子の転写活性化することを確認した．ボルケーノプロット分析とウエスタンブロット解析により，lnc53ACノックダウンはp53遺伝子を翻訳レベルあるいは翻訳後修飾に影響を及ぼしp53を活性化することがわかった．

p53ネットワークの理解と分子標的候補の探索

基盤研究(C)

研究期間:

2016年04月

2020年03月

時野隆至

p53遺伝子はヒト悪性腫瘍で最も高頻度に変異や欠失が検出される遺伝子であり，分子標的として注目されている．p53転写制御ネットワークの全貌を解明するために，新規p53標的遺伝子としてBRMS1L，ARVCFを同定し，その機能を解析した．p21転写誘導やsurvivin転写抑制などのp53経路制御において，BRMS1Lがp53の腫瘍抑制の機能を補強する可能性を示した．またp53変異によりARVCF発現が低下し，その結果，数100遺伝子の選択的スプライシングおよびp53標的分子の選択性を変化させることを明らかにした．

先進ゲノム解析研究推進プラットフォーム

新学術領域研究（研究領域提案型）『学術研究支援基盤形成』

研究期間:

2016年

2021年

小原雄治, 加藤和人, 川嶋実苗, 豊田敦, 鈴木穣, 三井純, 林哲也, 時野隆至, 黒川顕, 中村保一, 野口英樹, 高木利久, 岩崎渉, 森下真一, 浅井潔, 笠原雅弘, 伊藤武彦, 山田拓司, 小椋義俊, 久原哲, 高橋弘喜, 瀬々潤, 榊原康文

①総括支援活動では、応募の機会増加の要望に応えるため今年度から年2回の公募とした。その結果、合計466の応募課題があり、207課題(44%)を採択した。コロナ禍の影響の中、昨年度より応募数は100件近く増加したが、支援内容の精査や支援経費の限度額設定等により、40%超の採択率を維持した。審査委員はすべてプラットフォーム外の専門家とし、評価が同程度の場合は若手、女性、少額科研費からの課題、初めての応募課題を優先した。支援課題は科研費生物系のほぼすべての分野に渡っており、支援の成果を含む論文として2020年度に161報が発表された。この中には「単核貪食細胞系の分化における遺伝子発現制御機構の包括的解明」(Nature Immunol.)、「キンギョの変異体の表現型多様性を作り上げる分子機構の理解」(Current Biol.)、「植物二次代謝経路のゲノム進化に学ぶ生合成デザイン」(Nature Comm.)など広い分野でのレベルの高い成果が含まれている。拡大班会議や情報解析講習会はオンサイト開催が必要なためにコロナ禍の中で見送ったが、WEB開催としたヒトゲノム研究倫理を考える会は5回開催し、各回約500名が参加した。 ②大規模配列解析拠点ネットワーク支援活動においては、最先端技術を支援に提供するとともに、染色体レベルの高精度ゲノム配列決定、シングルセル・空間遺伝子発現解析等の支援技術高度化を進めた。 ③高度情報解析支援ネットワーク活動では、支援から浮かび上がった課題を解決するソフトウェアの開発を進め、実際の課題への適用を進めた。2020年度には、超高速相同性検索ソフトウェアPZLASTの開発、Hi-Cデータを使ったゲノムアセンブリソフトウエア、ロングリードシミュレータPBSIM2の開発などを進め、②と合わせて24報の論文を発表した。

p53経路の破綻による腫瘍悪性化の分子基盤の解明とその制御への応用

基盤研究(C)

研究期間:

2013年04月

2017年03月

時野隆至

新規p53標的遺伝子FOXF1およびICAM2についての機能解析を行った。この２つの標的遺伝子は細胞運動・浸潤を阻害し、発現抑制は細胞運動・浸潤を活性化した。p53ががん細胞の浸潤・転移に関与する標的遺伝子を転写制御していることを示唆している。 p53はmiR-200ファミリーを介してがん遺伝子CRKLの発現を抑制した。CRKL強制発現は腫瘍細胞の増殖・浸潤能を促進した。p53がmiRNA転写制御を介して腫瘍細胞の増殖・浸潤に関与するがん遺伝子の発現を抑制することを明らかにした。したがって、p53経路に異常のあるがんに対してCRKLを分子標的とした治療薬が有効なことを示唆する研究成果を得た。

バイオインフォマティクスを活用したp53ネットワーク探索と癌治療への応用

新学術領域研究(研究領域提案型)

研究期間:

2013年04月

2015年03月

時野隆至

p53結合モチーフ認識アルゴリズムを利用して，全ヒトゲノム配列探索により約64万のp53モチーフを同定した。アデノウイルスベクターでp53を発現させた肺がん細胞H1299における次世代シーケンサーを用いたクロマチン免疫沈降解析（ChIP-seq）によるピークと重複するものが20.0%であった。その内約半数は遺伝子間に存在することから，遺伝子介在性非コードRNA (lincRNA) がp53の標的となっている可能性が高いと考えられた。データベースに登録されている約14,000のヒト lincRNA のうち，その上下流10kbにp53モチーフと重複するChIP-seqピークを持つlincRNAを抽出した。qRT-PCRにより発現解析を行ったところ，23個のlincRNAがp53によって転写誘導されることを確認した。さらに機能的解析により，このうち特定のp53標的lincRNAの発現抑制がp53関連アポトーシス誘導を調整したり，特定の遺伝子群の発現を促進したりする結果を得ることができた。この結果は，腫瘍抑制を含めた多様な生理的機能においてp53とlincRNAが複雑な転写ネットワークを形成していることを示唆している。今後はこのようなp53の基礎的研究から新たな診断法やがん治療開発への臨床応用につながる研究をめざしたい。

MDM4-p53相互作用を分子標的とした革新的ながん治療製剤の探索

挑戦的萌芽研究

研究期間:

2011年

2012年

時野隆至, 古畑智久

p53経路の不活性化はヒトの発がん機構に共通に見られる特徴であり、p53経路のがん遺伝子MDM4による負の制御を阻害することは、p53経路の再活性化につなかる。本研究は、MDM4-p53結合を競合的阻害する新規の標的分子を探索する目的とする。本研究では12-merペプチドのファーファージディスプレイライブラリーを利用して1次スクリーニングを行い、p53-MDM4結合を阻害する新規のペプチドを探索した。その構造にもとづき、より高親和性を有することが予測されるペプチドを複数合成し、MDM4-p53結合を阻害する標的ペプチドを単離した。

がん研究分野の特性等を踏まえた支援活動

新学術領域研究(研究領域提案型)

研究期間:

2010年04月

2016年03月

今井浩三, 中村祐輔, 井上純一郎, 中村卓郎, 石川冬木, 山村研一, 荒木喜美, 八尾良司, 高野洋志, 高倉彰, 加藤秀樹, 中潟直己, 豊國伸哉, 鰐渕英機, 小川勝洋, 三森国敏, 山田泰広, 渋谷淳, 今井田克己, 二口充, 神田浩明, 田中英夫, 若井建志, 三上春夫, 鈴木貞夫, 三浦克之, 渡邊能行, 有澤孝吉, 田中恵太郎, 嶽崎俊郎, 古庄憲浩, 内藤真理子, 大中佳三, 喜多義邦, 栗木清典, 玉腰暁子, 江口英孝, 久保充明, 浜島信之, 永田知里, 樋野興夫, 田原栄俊, 椙村春彦, 津金昌一郎, 中杤昌弘, 高山哲治, 赤座英之, 高橋悟, 塚本泰司, 内藤誠二, 舛森直哉, 横溝晃, 並木幹夫, 藤本清秀, 藤岡知昭, 堀江重郎, 森満, 森脇久隆, 清水雅仁, 神奈木真理, 石田高司, 松岡雅雄, 山岡昇司, 田中勇悦, 渡邉俊樹, 安井寛, 土屋永寿, 醍醐弥太郎, 宮城洋平, 高橋隆, 矢守隆夫, 清宮啓之, 上原至雅, 吉田稔, 井本正哉, 深澤秀輔, 掛谷秀昭, 旦慎吾, 冨田章弘, 川田学, 長田裕之, 松浦正明, 水上民夫, 馬島哲夫, 牛嶋大, 時野隆至, 鈴木拓, 篠村恭久, 能正勝彦, 宮園浩平, 稲澤譲治, 広田亨, 野田哲生, 鈴木操, 竹田直樹, 柳沼克幸, 杉谷善信, 伊藤秀美, 細野覚代, 岩崎基, 永瀬浩喜, 西夛裕樹, 古野純典, 橋本修二, 山口一成, 高野淳, 寺本晃治, 松田浩一, 田中祐吉, 青木一郎, 長村義之, 中村直哉, 鈴木登, 田尻道彦, 川崎隆, 横瀬智之, 柳澤聖, 平川晃弘, 飯島祥彦, 前佛均, 佐々木泰史, 井戸川雅史, 丸山玲緒, 甲斐正広

がんの克服を目指す研究への支援から始まり、平成26 年度からは広く生命科学研究に携わる研究者も対象として支援を展開した。その結果、総括支援活動では若手研究者の育成ならびに今後研究支援に携わる可能性のある人材を育成し、国際学術交流を展開した。遺伝子改変マウスの供給支援、がん組織をはじめバイオリソースの提供支援等により、多くの世界的・先端的研究が展開された。日本を代表する疫学・ATL 研究では、得られた貴重な試料は11万検体を超え、多くの研究者を支援し貴重な成果を生み出した。化学療法基盤支援、ゲノム・エピゲノム支援は当初の目標を上回る成果を上げた。さらに市民講演会等により国民に支援の重要性を広報した。

口腔癌におけるSFRP遺伝子の発現解析と分子標的の開発

若手研究(B)

研究期間:

2009年

2010年

曽我部陽平, 荻和弘, 平塚博義, 時野隆至

本研究は口腔扁平上皮癌(OSCC)におけるSFRP遺伝子のエピジェネティックな不活化とWntシグナル経路関連因子の異常について解析したものである。本研究はOSCCにおけるSFRP遺伝子群のメチル化と発現消失を初めて明らかにした。OSCCにおいて他のWntシグナル関連遺伝子異常は稀であることから、SFRP遺伝子メチル化はWntシグナル活性化の要因の一つと考えられる。SFRPはOSCCの診断・治療において重要な分子マーカーとなりうることが示唆された。

RNA干渉技術を駆使してアポトーシス誘導シグナルを増強した遺伝子治療法の開発

挑戦的萌芽研究

研究期間:

2009年

2010年

時野隆至, 古畑智久

癌抑制遺伝子p53の導入による遺伝子治療が有効であると考えられるが、必ずしも著効するとは限らず、さらなる工夫が必要である。これまでに、我々はp21発現抑制miRNA/p53共発現アデノウイルスベクター(Ad-p53/miR-p21)を開発することで癌治療効果を増強することに成功した。そこで、更に別の標的遺伝子のひとつであるMDM2を特異的に発現抑制する人工miRNAの設計を行った。この設計配列を元に4種類のDNAオリゴを合成し発現プラスミドベクターに組み込んだ。このベクターをp53発現ベクターと共に大腸癌細胞HCT116にトランスフェクションしたところ、p53が強発現しているにもかかわらずMDM2の蛋白発現誘導の抑制が認められた。次に、相同組み換えを用いて、このベクターをアデノウイルスベクターAd-miR-MDM2を作成した。このアデノウイルスベクターをAd-p53/miR-p21と共に大腸癌細胞DLD-1に感染させたところ、MDM2の発現抑制によりp53の発現上昇と、それに伴うアポトーシスの増強効果が認められた。肝癌細胞Hep3Bおよび大腸癌細胞SW480にアドリアマイシンを併用した場合においても、miR-MDM2はAd-p53/miR-p21によるアポトーシス誘導を増強した。本研究において、p53発現ベクターにp21抑制miRNAおよびMDM2抑制miRNAベクターを併用することでアポトーシス増強効果を得ることに成功した。miRNA発現ベクターは、他のmiRNAをタンデムに接続することで複数の標的遺伝子の発現を抑制することが可能である。このため、他のアポトーシス阻害的な遺伝子に対するmiRNA設計し、複数を組み合わせることで相乗効果を得ることができる。この研究成果により、更なるp53遺伝子治療効果の増強および治療耐性の回避が期待できる。

細胞分裂制御遺伝子CHFRの機能解明および口腔癌の診断・分子標的薬の開発への応用

基盤研究(B)

研究期間:

2008年

2010年

時野隆至, 平塚博義, 荻和弘

癌抑制遺伝子CHFRは細胞周期M期チェックポイント機能を有し、E3ユビキチンリガーゼをコードするが、その標的基質分子および制御機構は不明な点が多い。本研究では、CHFR結合分子としてPARP-1を同定し、CHFRがこの標的分子である1本鎖切断DNA結合性のDNA 修復関連タンパクPARP-1のポリユビキチン化およびタンパク分解を介してM期チェックポイントを制御していることを突き止めた。またChfr欠損マウスおよびヒト口腔癌由来の細胞においてPARP-1タンパクレベルが有意に上昇していることを確認した。本研究はタキサン系抗癌剤抵抗性メカニズムの解明に貢献し、この抵抗性を示す口腔癌細胞において微小管阻害剤とPARP阻害剤とが有効な併用効果をもたらす分子機序を提唱する。

デジタルゲノムスキャニング法の開発と胃癌関連遺伝子探索への応用

萌芽研究

研究期間:

2007年

2008年

時野隆至, 古畑智久, 見田裕章, 明石浩史

癌遺伝子の増幅や癌抑制遺伝子の欠失を伴う染色体変化は癌細胞の特徴である.本研究では短いゲノム断片を解析しゲノム上のDNAコピー数以上を示す領域を検出する方法としてデジタルゲノムスキャニング(DGS: Digital Genome Scanning)法を開発し,胃癌細胞株におけるゲノムコピー数異常の検出を試みた. DGS法を利用して,ヒト胃癌細胞株においてKRASCACNAIC (calcium channel, viltage-dependent, 1 type, alpha-1c subunit)を含む2つの約500kbのゲノム領域を染色体12p12.1と12p13.33に同定した.KRAS遺伝子増幅を有する胃癌細胞株では,KRASのmRNAおよびタンパクレベルはKRAS遺伝子コピー数とよく相関していた.正常型KRASが遺伝子増幅した胃癌細胞では,血清刺激後に高レベルのGTP-KRASおよびリン酸化p44/42が検出された.一方,変異型KRASが遺伝子増幅した別の胃癌細胞では,恒常的に高レベルの活性型KRASおよびp44/42が検出された.この結果は,細胞増殖において正常型KRASの遺伝子増幅が無刺激条件下で選択優位性をもたらすのみならず,増殖因子刺激や高栄養環境の条件では点変異KRAS遺伝子と同様に著しい選択優位性を獲得可能なことを強く示唆している. 以上より,DGS法は癌を代表とするゲノムコピー数異常を呈する疾患の原因遺伝子探索において有効な手法となりうることを実証した.

細胞分裂制御遺伝子を分子標的とした口腔癌の診断と治療への応用

基盤研究(B)

研究期間:

2006年

2007年

時野隆至, 平塚博義, 荻和弘

1.CHFRと相互作用するタンパクの同定・解析 CHFRはRINGドメインを有するE3ユビキチンリガーゼであり、細胞が微小管阻害剤に暴露された際に染色体凝縮を遅らせる機能をもつ、新規の有糸分裂期チェックポイント分子であるが,がん細胞の微小管阻害剤感受性を規定するCHFRの生理的機能やその分子機構についての詳細は不明である。本研究では、CHFRの分子機能を明らかにする目約で、酵母ツーハイブリッド法を用いたCHFRの結合タンパクの同定を行った。その結果、標的の分解を誘導する一般的なE2ユビキチン結合酵素に加え、標的の分解を誘導しないE2酵素群がCHFR結合タンパクとして単離された。一方、CHFRのFHAドメインに結合する新規タンパクとしてgadd34が同定された。ドセタキセル存在下においてCHFRの一部は核から細胞質へ移行することによってgadd34と共局在し、このCHFRの局在変化の後に細胞死が誘導された。これらの結果は、gadd34とCHFRが分裂期ストレスに反応して協調的に細胞死を起こす機能を持っていることが示唆された。 2.CHFRがNF-kBシグナル経路に及ぼす阻害的効果次にCHFRによる転写制御に着目し、マイクロアレイ解析によりCHFRがNF-kBシグナル経路の制御に関わっていることを見出した。NF-kBの標的分子の一つであるIL-8が、CHFRにより制御されていることを見出した。IL-8のmRNAおよびタンパク質レベルは、CHFRの過剰発現により有意に抑制された。CHFRを過剰発現させた大腸癌細胞株HCT116細胞の培養上清でヒトさい帯静脈血管内皮細胞を処理すると、HUVECの遊走が減少した。本研究は、NF-kBシグナル伝達系の制御分子としてのCHFRの機能を初めて示すものであり、この機能によりCHFRが口腔癌の抑制に寄与している可能性が示唆された。

p53遺伝子ファミリーの機能解析とがん治療への応用

特定領域研究

研究期間:

2005年

2009年

時野隆至

ゲノムインフォマティクスを利用した新規p53標的遺伝子の予測は、発現解析との組合せによって新規標的遺伝子の同定に有用なこと明らかにした。マイクロアレイを利用したp73およびp63特異的標的遺伝子の検索を行い、新たにPEDF、FLOT2およびAPODなどの同定に成功した。p53ファミリー組換えアデノウイルスは、マウスモデルでの骨肉腫に対する遺伝子治療においてp53に比較して強力な腫瘍抑制効果を得た。また、p53とヒストン脱アセチル化酵素阻害剤FK228との併用効果もマウスモデルにおいて明らかにした。

p53遺伝子ファミリーの機能解析とがん治療への応用

研究期間:

2005年

2009年

時野隆至

p53遺伝子治療とヒストン脱アセチル化酵素阻害剤FK228との併用効果の検討 p53遺伝子治療の奏効率を高めるためには,p53依存性アポトーシス誘導に抵抗性の癌を克服する必要がある。最近,ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤(HDACI:histone deacetylase inhibitor)には細胞周期停止や細胞死誘導効果が報告されており,腫瘍細胞の増殖を抑制する新規の抗がん剤として注目されている。また,白血病などで第2相臨床試験が行われている天然化合物HDACIのFK228(depsipeptide)はCAR(coxsackievirus adenovirus receptor)の発現を増強させることによって,アデノウイルス感染を促進することが報告されている。本研究では,腫瘍細胞の増殖抑制におけるFK228前処理とAd-p53遺伝子導入の相乗効果を,細胞レベルおよびマウスモデルで検討した。その結果,FK228前処理はCARの発現増強を介してAd-p53感染効率を2-5倍増加させることによって,癌細胞のアポトーシス誘導を増強した。また,FK228はp53タンパクのアセチル化も促進し,その結果Noxaの発現誘導を特異的に増加させた。さらに,FK228とAd-p53との併用は,Baxタンパクのミトコンドリアへの移行を促進した。アポトーシス誘導におけるFK228とAd-p53の相乗効果は,siRNAを用いたNoxaとBaxのノックダウンによって顕著に阻害された。ヌードマウスin vivo皮下移植モデルにおいて,p53遺伝子導入単独では増殖抑制の見られなかった癌細胞株においても,FK228との併用によってアポトーシスが誘導され,増殖抑制効果が認められた。本研究により,FK228はp53遺伝子治療との併用薬剤として有望と考えられる。

デジタルゲノムスキャニング法の開発と消化器癌関連遺伝子探索への応用

萌芽研究

研究期間:

2005年

2006年

時野隆至, 古畑智久

癌遺伝子の増幅や癌抑制遺伝子の欠失を伴う染色体変化はがん細胞の特徴である.本研究では短いゲノム断片を解析しゲノム上のDNAコピー数以上を示す領域を検出する方法としてデジタルゲノムスキャニング(DGS: Digital Genome Scanning)法を開発し,胃癌細胞株におけるゲノムコピー数異常の検出を試みた. 胃癌細胞株ゲノムDNAを制限酵素処理した断片を回収し,連結したクローニングしたDNA断片の塩基配列を決定した.取得した塩基配列をヒトゲノム上にマップし,ゲノム上での断片の分布密度をもとにコピー数異常を示す領域を推定した.DGSで予測されたゲノム増幅領域に存在する癌遺伝子の候補については,次に,Southern blot, FISH, real-time RT-PCR, Western blot法などの分子生物学的手法で検証を行った.このDGS解析により,胃癌細胞株の第12番染色体短腕約0.5Mbのゲノム増幅が同定され,同領域に存在する癌遺伝子K-rasのゲノム増幅を確認した.K-ras領域のゲノム増幅は胃癌細胞株18種中4種で,また臨床胃悪性腫瘍50例中4例で検出された.また,K-rasの遺伝子増幅を示した胃癌細胞株ではMAP kinase(ERK1/2)の恒常的活性化が観察された. 以上より,DGS法はがんを代表とするゲノムコピー数異常を呈する疾患の原因遺伝子探索において有効な手法となりうることを実証した.

有糸分裂チェックポイント遺伝子CHFRの口腔癌診断・治療への応用

基盤研究(B)

研究期間:

2004年

2005年

時野隆至, 平塚博義, 木戸幸恵, 田中信幸

細胞周期チェックポイント機能における変異は口腔扁平上皮癌で頻繁に検出される。そしてそれはしばしば化学療法剤に対する癌細胞の感受性と関連することが明らかにされた。近年、様々なヒト癌細胞におけるマイトティックチェックポイント遺伝子CHFRはプロモーター領域のメチル化や点突然変異により遺伝子機能が不活化されることが報告されてきた。CHFRの機能の欠失はマイトティックチェックポイント機能不全に関連しており、このことは癌細胞で微小管重合阻害剤に対して感受性が高くなることを示している。本研究においては,CHFRの機能を欠失すると口腔癌細胞株ではヒストンH3のセリン10のリン酸化が引き起こされ、またcyclin B1の核移行の際には、分裂期の欠失によってチェックポイントの損傷が引き起こされることを明らかにした。CHFRの機能を欠失した口腔癌細胞株を微小管重合阻害剤(docetaxelまたはpaclitaxel)で処理したところ、アポトーシスを起こした細胞数はかなり増加した。さらにsiRNAにより遺伝子機能を障害した場合CHFRの分裂が障害された。それは口腔癌細胞株でG2/M期において細胞死させる機能が低下し、結果として微小管重合阻害剤感受性が高くなることを示唆する。本研究はCHFRが化学療法剤感受性に関する分子標的として有用性があることを示した。

p53転写制御因子ファミリーの細胞分化における役割

特定領域研究

研究期間:

2004年

2005年

佐々木泰史, 時野隆至

p53転写制御因子ファミリー(p53,p73,p63)は多彩な機能を有している.p53が代表的な癌抑制遺伝子であるのに対し,p63は,外胚葉性器官の発生や分化に,またp73は神経系の発生,炎症,アレルギーに関与していることが明らかになっている.我々もこれまでにp63およびp73がNotchシグナルを活性化できること,またp73がIL-4シグナルを介してT細胞の分化に関与していることを明らかにしてきた.本研究ではこれらの知見をさらに押し進め,p53ファミリーがどのような機構で増殖,分化,アポトーシスに関与しているかを明らかにすることを目標とし,以下の成果をあげた. 1)p73,p63に特異的な標的遺伝子としてpigment epithelium derived factor(PEDF)を同定した。PEDF遺伝子のプロモーターにはp73,p63に特異的な応答性配列が認められ,PEDFの発現はp73またはp63によって誘導されたが,p53では誘導されなかった.また,p73を強制発現させたヒト大腸癌細胞株の培養上清を骨由来細胞に添加したところ,細胞の分化を誘導した.この効果はPEDFに対する中和抗体によって阻害されたことより,PEDFがp73,p63の下流で細胞分化に関わっていることが示唆された。 2)p73,p63に特異的な標的遺伝子として細胞膜raftの主要構成分子をコードするflotillin-2を同定した.flotillin-2遺伝子のプロモーターにはp73,p63に特異的な応答性配列が認められた.さらに,p63を強発現させた細胞ではIL-6のシグナル経路が活性化しており,その効果はflotillin-2のsiRNAによって阻害された.以上の結果はp63あるいはp73がflotillin-2の発現調節を介して,細胞分化,炎症に関わっていることを示唆している. 3)ゲノムデータベースからのp53ファミリーに特異的な結合配列を抽出し,その近傍の遺伝子を解析した.その結果vitamin D receptor遺伝子など,p53ファミリーの機能を媒介し直接実行する標的遺伝子を同定した.

卵巣癌におけるエピジェネティクスの異常の解析と治療への応用についての研究

基盤研究(C)

研究期間:

2003年

2005年

藤井美穂, 寒河江悟, 豊田実, 時野隆至

MCA法による新しい遺伝子の同定:卵巣癌細胞株を用いMCA(methylated CpG island amplification)法により、正常細胞とでサブトラクションを行うことにより、卵巣癌での異常メチル化している多数の遺伝子を同定した。これは卵巣癌に抑制的に働く新たな遺伝子の発見につながるもので、現在遺伝子データベースを利用し各遺伝子について検討している。同時に各遺伝子のエピジェネティクな異常と卵巣癌での分子生物学的特徴について検討中である。 TCF2遺伝子についての解析:上記のMCA法により、メチル化によりサイレンシングしている遺伝子の一つとしてTCF2遺伝子を同定した。TCF2は細胞の分化に関与する転写因子であり、各種腫瘍において発現異常が報告されている。実際卵巣癌ではTCF2遺伝子のメチル化は、卵巣癌細胞株16例中8例(50%)、卵巣癌症例68例中16例(23.5%)に認めた。メチル化を認める細胞株においては、発現の低下あるいは消失を認め、DNAメチル化阻害剤により遺伝子の再発現を認めた。また、プロモーター領域のヒストン脱アセチル化を認め、メチル化による遺伝子発現抑制にヒストン修飾が関与することが示唆された。さらに組織型別では明細胞性腺癌ではメチル化による抑制は少なく高頻度な発現が認められた。これは卵巣癌の中でも予後不良な明細胞性腺癌の生物学的解明につながる可能性がある。(投稿中) 癌での細胞周期M期の制御の解析:これまで細胞周期M期に関わる遺伝子の異常と微小管阻害剤の感受性を検討してきた。ドセタキセルを暴露させたMitotic Indexの高い細胞株は抗癌剤に高い感受性を示し、CyclinBの核への集積が認められた。発現を調節している分子としてBUB1,MAD, Auroraなどの分子について検討中である。さらにCHFR遺伝子を細胞株に導入することによって、M期での分子制御機構の解明や抗癌剤の感受性の変化についても検討中である。

遺伝子あるいは発現プロテオミクス解析を用いた婦人科癌抗癌剤耐性の分子標的の研究

基盤研究(C)

研究期間:

2003年

2005年

寒河江悟, 寺澤勝彦, 時野隆志, 工藤隆一

寒河江、寺澤らは、Paclitaxel, Docetaxel、新規抗癌剤Oxaliplatinに対してそれぞれ感受性のある細胞株、それらに対する耐性株を用いて、これら細胞株に一定時間、各種抗癌剤を暴露した後、その投与前後における薬剤耐性関連遺伝子群発現のパターンの変化をcDNAアレイなどを用いて検討した。現在、CDDP、Paclitaxel、Docetaxel、254-Sに対するCDDP、Paclitaxel感受性株、耐性株の薬剤投与前後のアレイパターンを解析して、それぞれの薬剤、細胞株に特異的な遺伝子群を検討し、薬剤耐性の機序を解析している。さらに寒河江、寺澤らは、蛋白レベルでの検討のため手術摘出物より極力プロテオリーシスの起きない状況下で蛋白サンプルを採取し、これを電気泳動により展開し、蛋白レベルでの抗癌剤耐性に関与する蛋白の変化をmRNAレベルでの変化と比較検討した。また蛋白質を2-D電気泳動で展開、分離し、2-Dマップを作製、薬剤毎、抗癌剤感受注毎にデータベース化を試みている。今後、こうしたDifferential proteomic displayにより、変化のあったスポットを酵素消化後、質量分析計あるいはシークエンサーにて同定を試みる予定である。これにより、各薬剤毎に薬剤感受性、耐性に関与する蛋白、特にアポトーシス関連蛋白を選定し、同蛋白に対する抗体の作製、及び同抗体の抗癌剤感受性及び耐性に及ぼす影響の実験の基礎としたいと考えている。

家族性小児ウィリス動脈輪閉塞症の原因遺伝子の探索

基盤研究(B)

研究期間:

2002年

2004年

寶金清博, 時野隆至, 多田光宏

1、研究目的本研究では、本疾患に特異的な遺伝子異常や遺伝子発現の異常を探索した。以下の3つの視点から研究を行った。 1)血液サンプリングによる家族発症もやもや病症例の遺伝子解析 2)家族性もやもや病における表現促進現象とtriplet repeatの伸張の検討 3)手術中に得られた患者の脳脊髄液のサイトカインの解析 2、対象および方法 1)家族性もやもや病関連遺伝子の探索(17q25の領域) 以下の3つの手法で探索を行った I)bioinformaticsの手法を用いた遺伝子探索 II)既知遺伝子に対する変異解析 III)SNPs解析 2)家族性もやもや病における表現促進現象とtriplet repeatの伸張の検討もやもや病と141例を対象として17q25の領域のtriplet repeat伸張の有無を検討した。 3)手術中に得られた患者の脳脊髄液のサイトカインの解析手術中に得られる脳表面の脳脊髄液のサイトカインの測定を行った。測定はELISA法で行った。 3、結果 1)遺伝子探索約250のUnigene Clusterをアミノ酸に翻訳して、ドメイン検索や他の機能タンパクとの相同性解析を行ったが、既知遺伝子の他には、明らかに原因遺伝子として適当なUnigene Clusterを検出することはできなかった。既知遺伝子に対する変異解析これまでに、DNAI2、AANAT、PSR、HCNGP、HN1、SGSH、SYNGR2、EVPL、TIMP2などの変異解析を行っているが、本症に特異的な遺伝子変異は認められていない。TIMP2の8つのSNPについては、患者特異的なSNPは認められなかった。 2)家族性もやもや病における表現促進現象とtriplet repeatの検討家族性もやもや病において,表現促進現象の存在が示唆された。もやもや病を発症者において繰り返し数が10である伸長を認めたが,今回検討した17q25の領域では、家族性もやもや病家系における発症症例と非発症症例では,有意差は認められなかった。 3)髄液中サイトカイン測定もやもや病患者においては、b-FGF、HGFの高値が測定された。

転写制御因子p63の発生,分化における役割

特定領域研究

研究期間:

2002年

2003年

佐々木泰史, 時野隆至

1.正常の発生段階あるいは細胞分化においてp53ファミリーメンバーの機能を媒介し直接実行する標的遺伝子を決定するために,p53ファミリーをいくつかのヒト癌細胞株に導入し、cDNA microarrayによる発現解析を行った.その結果,p73の特異的標的遺伝子としてIL-4Rα遺伝子を同定した.さらにIL-4Rαゲノムにp73タンパクと細胞内で特異的に結合する部位を同定し,p73がこの配列に結合することによりコファクターがリクルートされ,ヒストンのアセチル化が促進されることを明らかにした.またp73が活性化した細胞をIL-4で刺激すると,STAT6の活性化とアポトーシスが誘導され,この効果はIL-4Rの中和抗体により抑制された.この結果はp73がIL-4シグナルを介して細胞の分化,炎症,アレルギーに関わっていることを示唆している. 2.p53ファミリー共通の標的遺伝子としてosteopontin(OPN)を同定した.OPNは主に活性化T細胞から分泌されるサイトカインで,骨組織の形成に不可欠だけでなく,B細胞の分化増殖や抗体産生能に重要な役割を果たしていることが示された.この結果はp53ファミリーの機能に関する新しい知見と考えられる. 3.p53ファミリーにおいて最も最も高親和性で結合するDNA配列には違いがあり,スペイサーが介在するp53結合モチーフ配列RRRCWWGYYYの3コピー以上で構成される配列が,p63あるいはp73の高親和性応答配列として働くことが示唆された.従ってp53ファミリーは結合配列に対する親和性の違いにより標的遺伝子の使い分けをしており,生体においては単純に機能が重複している遺伝子ファミリーではないことを明らかにした.

p53とその標的遺伝子群の機能解析

特定領域研究

研究期間:

2000年

2004年

時野隆至

1.新規p53標的遺伝子本研究ではp53の生理機能の全貌を解明する目的で、RDA法によりp53欠損マウス胎仔線維芽細胞p53(-/-)MEFと正常MEFで発現量の異なる21種類の遺伝子を同定し、そのうちOPNおよびSCN3Bがp53の直接の標的遺伝子であることを報告した。また比較ゲノム解析を利用して機能的p53応答性配列をゲノムから包括的に抽出し、ヒトゲノムからp53標的の候補遺伝子として60遺伝子を同定し、さらにその約半数がp53応答性のエンハンサー配列として機能することを明らかにした。この方法により同定した新規p53標的遺伝子VDR(vitamin D receptor)について詳細な解析を行った。 2.生体におけるp53ファミリーの役割 p53ファミリーの生理機能の全貌を解明する目的で、cDNAマイクロアレイ解析を利用したp53ファミリーの各メンバー特異的な標的遺伝子の解析を行った。p73あるいはp63によって特異的に発現が誘導される標的遺伝子としてPEDFを同定した。p63はNotch受容体リガンドをコードするJAG1遺伝子を特異的に発現誘導し、p73はIL-4Rα遺伝子を特異的に発現誘導することを見出し、それぞれ直接の標的遺伝子であることを明らかにした。 3.p53ファミリー一遺伝子の機能解析と癌治療への応用ヒト悪性腫瘍由来細胞株にアデノウイルスベクターを用いてp53とそのファミリー遺伝子を導入し、アポトーシス誘導能を比較検討した。興味深いことに正常型p53をもつ細胞株においてはp73βやp63γがp53よりも強力にアポトーシスを誘導する傾向が得られた。さらにマウスin vivo皮下移植モデルにおいては、p53あるいはp63γの単独導入ではアポトーシスに抵抗性であった細胞株でAd-p53とAd-p63γの同時投与により相乗的な腫瘍縮小効果が認められた。

婦人科癌におけるDNA修復遺伝子,βカテニン,SKT11などの遺伝子異常解析

基盤研究(C)

研究期間:

1999年

2001年

寒河江悟, 工藤隆一, 時野隆至, 石岡伸一

本研究では子宮内膜癌や卵巣癌での遺伝子異常の解明を行い、子宮内膜癌で23%、卵巣癌で3%のRER異常を認めた。とくに卵巣癌では類内膜型におけるRERの検討を行い、組織型として共通の遺伝子異常の存在が推察された。また子宮内膜癌においてRER陽性例は予後不良傾向があった。またRER陽性例にMMR遺伝子(hMLH1,hMSH2)の変異は1例のみであった。さらに、卵巣癌61例、子宮内膜癌35例についてβ-catenin遺伝子の変異およびその蛋白の発現を検討し、それぞれ5例(8%)、5例(14%)にβ-catenin遺伝子の変異を確認した。骨盤リンパ節への微小転移の検出にもβ-catenin遺伝子の変異の存在が有用であった。またPeutz-Jegher Syndromの原因遺伝子としてSerine/Threonine Kinaseの働きをしているSTK11がごく最近報告され、30例の卵巣癌においてSTK11の変異をSSCP-Sequence分析で検討した。exon6のCCG-CTG(Pro281-Leu)の変化が1例認め、さらにSSCPにてexon5に2例のextra bandを認めた。卵巣癌の新規抗癌剤としてTaxolあるいはTaxotereが使用され、その化学療法の有効性を治療前にそれぞれの薬剤ごとの予知が可能かをp53,BAX, Bcl-2などの遺伝子発現を検討することで、薬剤耐性の機序解明を試みた。その結果、卵巣癌株におけるTaxol誘発apoptosisの発現にはp53とは独立した経路とストレス反応に誘発された経路が重要な役目を担い、これらの抑制とbag-1やhsp70の過剰発現がTaxolの獲得耐性に重要であることが判明した。

ヨーロッパなどががん研究先進国との研究交流

特定領域研究(A)

研究期間:

1999年

黒木登志夫, 石川冬木, 樋野興夫, 菊池章, 開祐司, 宮園浩平, 佐谷秀行, 貝淵弘三, 山本雅, 時野隆至, 秋山徹, 高橋雅英, 田中信之, 武藤誠, 堀井明

1.研究背景: がん遺伝子の発見をきっかけに、がん研究は遺伝子の時代に入り、欧米のがん研究先進国を中心に激しい研究競争を繰り広げている。地理的に隔離されているわが国の研究者は、研究者との直接の討論、情報、資料交換に自ら制限があり、ともすると孤立しかねない。この問題点を克服するため、わが国の第一線の研究者を積極的にがん研究先進国に送る必要がある。本研究は、ヨーロッパのがん研究先進諸国との研究交流を目的に組織された。特に、日独、日仏がんワークショップはそれぞれ一年毎にヨーロッパ本国と日本と場所をかえて行われているが、本年度は日独をヨーロッパで、日仏を日本で開催した。本年度は10名をヨーロッパ諸国に派遣した。 2.日独がん研究連絡会議: 1999年7月29〜31日独国・エッセン、エッセン大学において「分子細胞生物学的がん研究」に関する日独がんワークショップを開催した。わが国から黒木登志夫(昭和大・腫瘍分子研)、秋山徹(東大・分生研)、菊池章(広島大・医)、樋野興夫(癌研)、石川冬木(東工大・生命理工学)が本研究費で出席した。 3.日仏がん研究連絡会議: 1999年9月8〜10日、東北大学・医学部において、「21世紀のがん研究に向けての新しい戦略」をテーマに日仏ワークショップが開催された。フランス側から12名、わが国からは黒木登志夫(昭和大・腫瘍分子研)、石川冬木(東工大・生命理工学)、宮園浩平(癌研)、広橋説御、塚田俊彦、落合孝広(国立がんセ・研)、渋谷正史、中村祐輔(東大・医科研)、中山敬一(九大・生医研)、月田承一郎、武田俊一(京大・医)、伊藤嘉明(京大・ウイルス研)、菅野晴夫(癌研)、豊島久真男(住友病院)が本研究費で出席した。 4.その他の派遣者: 宮園浩平(癌研)、藤井穂高(東大・医)、丸義朗(東大・医科研)、開祐司(京大・再生医研)、千葉英樹(札幌医大・医)をヨーロッパの先進研究室に派遣した。

p53標的遺伝子の機能解析

特定領域研究(A)

研究期間:

1999年

時野隆至

1.ヒトゲノムからp53結合配列のスクリーニングを試み,p53標的遺伝子の単離とその機能解析を行った. (1)その中で7回膜貫通蛋白をコードするBAll遺伝子をグリオブラストーマ細胞に導入しin vivoで観察をした結果,BAllを導入した癌細胞株では血管新生が著明に抑制されたことを確認した.さらに酵母two-hybrid系を用いて,BAll遺伝子産物と相互作用する蛋白をコードする3つの新規遺伝子を同定した. (2)GMLの発現と種々の悪性腫瘍由来細胞株においてDNA障害性薬剤を中心とした抗癌剤に対する感受性に相関が認められた.GMLの機能解析を行うため,GML発現が癌細胞へ与える影響を検討した.3種類のヒト癌細胞にGML遺伝子を高レベルに発現させた場合,細胞増殖には影響を与えないが,抗癌剤あるいは放射線に対する感受性の増加が認められた.グリオブラストーマ細胞T98GにGMLを強発現させると,アポトーシスによる細胞死を誘導することが確認された. 2.p53ファミリー遺伝子p73,p51とp53の転写活性化能,細胞増殖抑制能,アポトーシス誘導能について比較し,以下の点を明らかにした. (1)p53に比べると弱いが,p73βおよびp51Aは内在性p21蛋白誘導能を示した.この結果はp53応答性配列を介した転写活性能の結果と一致した. (2)p73,p51を発現する組み換えアデノウイルスを作製した.DNA断片化を指標にアポトーシス誘導能を検討した結果,複数のヒト癌細胞株において,Ad-p73βおよびAd-p51AはAd-p53に比べて強いアポトーシス誘導能を示した. (3)細胞増殖抑制能とp21発現誘導能の結果から,細胞死を誘導するためのp73およびp51の標的遺伝子はp53標的遺伝子とは異なる可能性が示唆された.

罹患同胞対法を用いた胃がん関連遺伝子の解明

特定領域研究(A)

研究期間:

1999年

笹月健彦, 松野正紀, 横田淳, 伊東文生, 磨伊正義, 三輪晃一, 時野隆至

胃がんの発症に寄与するがん関連遺伝子の単離を目的として、胃がん罹患同胞対検体収集、若年発症弧発胃がん症例検体の収集を継続し、罹患同胞対法による全ゲノムスキャニングを行った。 1.17施設の臨床グループにより、胃がん同胞発症対から、インフォームド・コンセントに基づいて採血を行い、DNAの抽出・保存を行った。これまでに70組の同胞対検体が収集された。 2.上記の胃がん同胞発症対57組に対して、4施設の解析グループにより400個のマイクロサテライトマーカーを用いたDNA多型解析を行った。MAPMAKER/SIBのプログラムを用いた連鎖解析を、全染色体について終了した。第1、8、9、11、21染色体において1.0以上のLOD値を示す領域を見出した。 3.健常対対照群326人のDNAを利用して、日本人集団における各マーカーのアリル同定の作業を4施設の解析グループにより完了した。 4.若年胃がん発症例(弧発例)の末梢血の採取を開始し、これまでに100人(発症時平均年齢41.6歳)のDNAが抽出・保存された。これまでの57組を対象とした解析において、1以上のLOD値を示す上記染色体が同定されたことは注目に値する。解析数を増やすこと、若年発症弧発例を用いて解析すること等により胃がん発症との関連を確認する。

脳特異的血管新生抑制因子BAI1遺伝子導入によるグリオーマの血管新生抑制療法の開発

基盤研究(B)

研究期間:

1998年

1999年

有田憲生, 中野敦久, 松本強, 蒲恵蔵, 時野隆至, 泉本修一, 平賀章壽, 大西丘倫

1.脳腫瘍臨床標本を用いた研究グリオーマ臨床標本を用いて、(1)BAI1遺伝子発現量、(2)p53遺伝子変異、(3)BAI1遺伝子発現とp53遺伝子変異との相関、(4)BAI1遺伝子発現と腫瘍血管密度との相関、を検討した。その結果、(1)半定量的RT-PCR法で正常脳と発現量と比較すると、グリオーマの約70%でBAI1発現量が低下していた。発現量の低下は、悪性度が高いほど高頻度で見られた。(2)PCR-SSCP法でp53変異を検索した。その結果グリオーマの約30%で、p53タンパクのDNA結合能に影響すると考えられる変異を認めた。(3)BAI1遺伝子発現量低下とp53遺伝子変異の間には、有意の相関は認めなかった。 (4)グリオーマ組織を抗CD34抗体で免疫染色し、腫瘍内の血管を定量評価した。BAI1遺伝子発現正常例と比較すると、BAI1発現低下例で腫瘍血管数は増加していた。以上の結果より、悪性グリオーマの少なくとも一部では、p53遺伝子変異によるp53タンパクの転写活性能の喪失以外の機序によるBAI1発現低下が生じていると考えられる。BAI1発現低下腫瘍では、BAI1遺伝子導入によるBAI1タンパクの強制発現が、血管新生を抑制すると思われる。 2.グリオーマ培養細胞株におけるBAI1遺伝子の機能解析 BAI1遺伝子の強制発現と血管新生抑制、腫瘍増殖能、分化などとの関係をみる目的で、テトラサイクリン存在下で導入遺伝子を発現させることのできるTet-On system(Clonetech)を用いて、BAI1遺伝子導入グリオーマ細胞株を作成中である。T98G、U87MG細胞を用い、現在株の樹立の最終段階を進めている。株の確立次第、マウス移植モデルを用いて、血管新生抑制などの解析を予定している。

カルニチン輸送担体遺伝子のポジショナルクローニングとその病態生理への関与

基盤研究(B)

研究期間:

1996年

1997年

桑島正道, 時野隆至, 村上尚, 野間喜彦

カルニチンのin vivoにおける役割は明確でなく、不明な点が多かった。しかしこのような否定的な認識は、私共の見いだした全身性カルニチン欠乏マウス(JVSマウス)の出現により一変した。このJVSマウスは、脂肪肝、高アンモニア血症、低血糖症、心肥大、骨格筋変性などの症状を合併しており、我々は全身組織の組織学的、生化学的、分子生物学的分析をすすめながら、上記の多彩な症状とカルニチン欠乏との関係を分析している。本研究において明確になった点は次のことである。 1)JVSマウスにおいては、生後2週齢より早くも心重量、心体重比ともに対照に比し大きくなっていた。心筋細胞の肥大がみられ、また核が大きくなる傾向があった。電顕像では核はやや肥大しミトコンドリア増加の著明な細胞も少なくなかった。また、カルニチンパルミトイルトランスフェラーゼ(CPT)I、CPIIのmRNAの発見に異常がみられた。 2)JVSマウスの線維芽細胞において、高親和性のカルニチン輸送活性が消失していることを見いだし、JVSマウスが、ヒトにおける原発性カルニチン欠乏症のanimal modelであることを明らかにした。 3)JVSマウスの症状は常染色体劣性の遺伝形式で伝わり、疾患遺伝子(JVS遺伝子)は単一であると考えられている。連鎖解析の結果、JVS遺伝子はマウス第11番染色体上に存在することを見いだした。

癌抑制遺伝子の単離とそのヒト癌における遺伝子異常の解明

重点領域研究

研究期間:

1995年

時野隆至, 中村祐輔, 江見充, 藤原義之

32人の食道癌患者の種々の段階の106病変(異形成・早期癌・進行癌)における遺伝子異常を、マイクロサテライトマーカーを利用した染色体欠失を指標として解析し、3p,17pの癌抑制遺伝子の不活性化が異形成の段階ですでに起こっていることや9p,9qの癌抑制遺伝子の不活性化は癌化の段階で重要な役割をしていることなど、食道癌においても多段階的に遺伝子異常が蓄積されていることを明らかにした。また、種々の臓器の扁平上皮癌の発生に共通して関与していると考えられる第9染色体長腕の遺伝子については、数百kbの範囲まで癌抑制遺伝子の存在部位を限局化することができた。遺伝性癌の原因遺伝子のひとつであるMLH1遺伝子の変異を効率よく検索し発症前診断に応用するために、この遺伝子の全エキソンを1枚のゲルで解析するスクリーニング法を確立した。この方法によって全エキソンの変異の有無の検索を24時間以内に行うことが可能となった。さらに、リンパ節転移の有無を原発巣において認められる遺伝子異常を指標として遺伝子レベルで診断することの臨床的意義を調べるため、120例の病理組織学的にリンパ節転移陰性と診断された大腸癌患者についてレトロスペクティブに検討を行った。その結果、遺伝子診断はより正確な予後判定指標であり、術後の化学療法の適否を判断するための有用な指標になりうることが示唆された。また、抗p53抗体による免疫組織学的な検討の結果と遺伝子診断の結果との対比から、MASA法による解析によって生きた癌細胞のみならず、免疫細胞に呑食された癌細胞をも検出可能であることが示唆された。次に、p53蛋白の結合すると考えられるDNA断片を有するコスミドクローンを単離し、それらをもとに正常p53蛋白によって発現が誘導される2種類の新規の遺伝子の単離に成功した。

がんの遺伝子診断

重点領域研究

研究期間:

1994年

1996年

珠玖洋, 安井弥, 高橋隆, 森下和廣, 時野隆至, 金子安比古, 谷口直之

1.胃癌組織40例において、CDC25Aは45%、CDC25Bは70%(28症例)において発現増強が認められ、CDC25Cは全てで低発現だった。CDC25Bは低分化腺癌症例、ステージの進んだ症例に発現増強が認められた。又、分子病理診断の一つとしてCAr ep eatを2ローカス、polyAを2ローカス検討し、約5%の症例でreplication errorを同定した。分子病理診断は9000例にいたった。 2.208症例の非小細胞癌症例でcyclinD1およびRb遺伝子の検討を行ったところ、cyclinD1遺伝子発現の消失がみられた腺癌症例は、有意に短い術後生存期間を示した。多変量解析でもcyclinD1はp53、病期と共に独立した有意な予後因子だった。 3.神経芽腫106例を対象として、1p36のD1Z1と1q12のD1Z1プローブを用いてFISH法で検討した。D1Z1の数(n数)、およびD1Z1数に比してのD1Z2数(D1Z1>D1Z2;b;D1Z1=D1Z2;a)更に、RFLPマーカーによる1pのLCH、及びN-myc増幅を合わせて検討した。その結果、2nb、4nb腫瘍は予後不良、3n、5n腫瘍は予後良好、2na、4na腫瘍はその中間であった。 4.急性骨髄性白血病における第三染色体の異常をEVI1遺伝子を中心として解析した。t(3;7)転座を有する症例、t(1;3)転座を有する症例の切断点および遺伝子を同定した。又40症例の白血病においてガングリオシドGM3からのGD3の合成酵素、α2,8シアル酸糖転移酵素の発現を検討したところ、T-ALLで中等度の、ATLで高い遺伝子発現が認められた。 5.p53の下流標的遺伝子の検索を進め、8種類の正常型p53により発現制御される遺伝子を同定した。そのひとつはGPl anchor ed mol eculeに属する新しい遺伝子であり、その発現は食道癌細胞株の抗癌剤感受性と強い相関性を示した。 6.AFPやγ-GTPの糖鎖に癌性変化を起こすα1,6 fucosyltr ansfer aseの精製を行いそのcDNAを単離した。

癌抑制遺伝子解析のためのヒト第3染色体遺伝的地図の作成および遺伝子の同定

一般研究(A)

研究期間:

1990年

1991年

中村祐輔, 土屋永寿, 北川知行, 時野隆至, 佐藤孝明

癌における癌抑制遺伝子の異常は一般的に一方の染色体側の欠失と他方の染色体側の小さな変異(点変異や小さいDNA断片の挿入・欠失)として認められる。したがって、対象とする腫瘍組織において欠失している染色体部位を詳細に検討することにより、その腫瘍の発生に関与する癌抑制遺伝子の存在する位置を同定することが可能である。われわれは肺の非小細胞癌の発生に関わる癌抑制遺伝子を単離することを目的として49例の腺癌・18例の扁平上皮癌におけるヒト第3染色体短腕領域の欠失について、19のRFLPマ-カ-を利用して調べた。この結果、49例の腺癌のうち33例(67%)がこの染色体の欠失を起こしていたことが明かとなった。また、比較的多くの症例がこの染色体の一部分だけを欠失していることがわかった。さらに複数の腫瘍に共通して欠失している領域は3p21.3と3p14.1ー21.1の2領域であることが同定され、第3染色体上には肺の腺癌の発生に関与する癌抑制遺伝子は少なくとも2個存在すると推測される。さらに、染色体欠失の頻度とステ-ジを比較したところ、ステ-ジ1・2では30例中17例が欠失していた(57%)のに対し、ステ-ジ3では19例中16例(84%)の高頻度の欠失を認めた。また、病理学的分化度との対比では高分分子化癌では22例中12例(55%)の欠失頻度であったのに対し、未分化癌では7例中7例とも欠失していた。このことから、第3染色体上の癌抑制遺伝子の異常は肺腺癌の増悪因子としてとらえられるのではと考察される。また、扁平上皮癌では18例すべてにおいて、第3染色体短腕の欠失を認め、欠失領域も腺癌と比べて大きな領域であった。したがって、どの染色体の部位に問題となる遺伝子が存在するかを特定することはできなかった。今後は、さらに用いるRFLPマ-カ-の数を増やして、多数のサンプルを調べ、遺伝子の単離を目指したい。

DNA増幅法(PCR法)による高多型VNTRマ-カ-の単離

一般研究(C)

研究期間:

1990年

1991年

時野隆至

最近、多用されているミクロサテライトDNAの多型を効率よく同定する方法をテストした。ヒトゲノムコスミドライブラリ-に対してオリゴヌクレオチドCACACACACACACACACACAを用いてスクリ-ニングしたところ、約40%のクロ-ンが陽性であった。ミクロサテライト多型はくり返し配列の両側の配列を決定し、この配列からプライマ-を設計してPCR法(Polymerase Chain Reaction法)によりヒトゲノムDNAを増幅し、アクリルアミドゲル電気泳動によって長さに従ってDNAを分離することによって同定される。この際、最も労費を要するのはくり返し配列両側のDNAの配列を決定することである。そこでこのステップを簡便化するためにCAを10回くり返したオリゴヌクレオチドの3'側にA,GあるいはTを加えたもの、CC、CT、もしくはCGを加えたものの6種類のプライマ-をミックスしたものを直接コスミドのDNA配列を決定するプライマ-として用いた。この結果、約30%のクロ-ンがこれで直接配列を決定することが可能であった。3種類ずつにしたものでは約70%のクロ-ンがシ-クエンス可能であった。今後、この方法を利用してCAのくり返しによる多型を同定していくことが可能であると考える。

乳癌・大腸癌における癌抑制遺伝子の単離

がん特別研究

研究期間:

1990年

中村祐輔, 三木義男, 西庄勇, 時野隆至, 佐藤孝明

乳癌に関しては200例の乳癌患者の正常および癌組織よりDNAを抽出し、RFLPマ-カ-による染色体の欠失を調べた。全染色体にわたる40個のRFLPマ-カ-によって検索した結果、第3染色体(45%)、第13染色体長腕(28%)、第16染色体長腕(46%)、第17染色体短腕(57%)、第17染色体長腕(38%)に高頻度の欠失を認めたことから、これらの部位に癌抑制遺伝子の存在することが示唆された。また、erbB2遺伝子領域の増幅と第17染色体短腕の欠失との間強い相関(p<0.001)が認められたことから染色体の異常は独立しておこるのではなく、ひとつの異常が他の異常を起こし易くする可能性が考えられた。また、第13染色体の欠失も第17染色体の欠失が影響している可能性が示されるとともに、この染色体上の癌抑制遺伝子の欠失が、癌の増悪に関係することが病理学的な診断との比較により示唆された。また、それぞれの染色体における共通欠失領域の同定も行い、第3・16・17染色体については5〜10cMの領域に癌抑制遺伝子の存在部位を限定している。大腸癌については、第5染色体の家族性大腸腺腫症の原因遺伝子の検索を中心に研究を行った。一人の患者からの複数個の腺腫と癌における染色体欠失を調べたところすべての腫瘍が同一領域を欠失していたことから染色体欠失はランダムに起きるのではなく特別なメカニズムによって起こっていることが示唆された。さらに、家族性大腸腺腫症患者において同定した200kbの欠失領域近傍より単離した3種類のcDNAのひとつが大腸癌において欠損あるいはアミノ酸置換をおこす点変異を起こしていることが明かとなった。この遺伝子はG蛋白活性化ドメインと考えられる領域を有し、大腸癌の発生に関与する癌抑制遺伝子であり、MCC(Mutated in colorectal carcinoma)遺伝子と名付けた。

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<時野 隆至>

共同研究・競争的資金等の研究課題 - 時野 隆至

<時野　隆至>

共同研究・競争的資金等の研究課題 - 時野　隆至