共同研究・競争的資金等の研究課題 - 時野　隆至

新規がん治療法の開発をめざしたp53との合成致死に関与する遺伝子群の探索

基盤研究(C)

研究期間:

2022年04月

-

2025年03月

 

時野 隆至

p53経路の破綻による腫瘍悪性化の解明と分子標的治療への応用

基盤研究(C)

研究期間:

2019年04月

-

2023年03月

 

時野 隆至

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p53はヒト悪性腫瘍で最も高頻度に変異している遺伝子であるが，「がん抑制遺伝子」であるためp53経路をターゲットとした抗がん剤の開発は遅れている．そのためp53転写ネットワークの全貌を解明することは，がんゲノム情報にもとづいたがん治療に有望な分子標的治療薬の開発につながることが期待できる． 本年度は，p53の活性化に関与する長鎖非コードRNA (long non-coding RNA; lncRNA) を探索した．本研究では，TCGA (The Cancer Genome Atlas)のがんゲノムデータを利用して，正常大腸上皮細胞と比較して大腸がん細胞で高発現し，かつ高発現群で予後不良と相関するlncRNAを10個同定した．このうちの1つのlncRNAに注目し，正常型p53遺伝子をもつ大腸がん細胞株HCT116(p53+/+)においてこのlncRNAをノックダウンし，次にRNAシーケンス (RNA-seq) により発現変動遺伝子を網羅的に解析した． その結果，コントロールHCT116(p53+/+)細胞と比較してこのlncRNAノックダウンHCT116(p53+/+)細胞で，p53の代表的標的遺伝子遺伝子CDKN1A（p21タンパク質をコード）の発現が最も有意に上昇していた．そこで，第16番染色体に位置するこの長鎖非コードRNAをlnc53AC（仮称）と名付けた．p53遺伝子をノックアウトしたHCT116(p53-/-)細胞ではCDKN1A遺伝子の発現上昇は見られず，lnc53ACはp53依存的にCDKN1A遺伝子の転写活性化することを確認した．ボルケーノプロット分析とウエスタンブロット解析により，lnc53ACノックダウンはp53遺伝子を翻訳レベルあるいは翻訳後修飾に影響を及ぼしp53を活性化することがわかった．

p53ネットワークの理解と分子標的候補の探索

基盤研究(C)

研究期間:

2016年04月

-

2020年03月

 

時野 隆至

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p53遺伝子はヒト悪性腫瘍で最も高頻度に変異や欠失が検出される遺伝子であり，分子標的として注目されている．p53転写制御ネットワークの全貌を解明するために，新規p53標的遺伝子としてBRMS1L，ARVCFを同定し，その機能を解析した．p21転写誘導やsurvivin転写抑制などのp53経路制御において，BRMS1Lがp53の腫瘍抑制の機能を補強する可能性を示した．またp53変異によりARVCF発現が低下し，その結果，数100遺伝子の選択的スプライシングおよびp53標的分子の選択性を変化させることを明らかにした．

先進ゲノム解析研究推進プラットフォーム

新学術領域研究（研究領域提案型）『学術研究支援基盤形成』

研究期間:

2016年

-

2021年

 

小原 雄治, 加藤 和人, 川嶋 実苗, 豊田 敦, 鈴木 穣, 三井 純, 林 哲也, 時野 隆至, 黒川 顕, 中村 保一, 野口 英樹, 高木 利久, 岩崎 渉, 森下 真一, 浅井 潔, 笠原 雅弘, 伊藤 武彦, 山田 拓司, 小椋 義俊, 久原 哲, 高橋 弘喜, 瀬々 潤, 榊原 康文

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①総括支援活動では、応募の機会増加の要望に応えるため今年度から年2回の公募とした。その結果、合計466の応募課題があり、207課題(44%)を採択した。コロナ禍の影響の中、昨年度より応募数は100件近く増加したが、支援内容の精査や支援経費の限度額設定等により、40%超の採択率を維持した。審査委員はすべてプラットフォーム外の専門家とし、評価が同程度の場合は若手、女性、少額科研費からの課題、初めての応募課題を優先した。支援課題は科研費生物系のほぼすべての分野に渡っており、支援の成果を含む論文として2020年度に161報が発表された。この中には「単核貪食細胞系の分化における遺伝子発現制御機構の包括的解明」(Nature Immunol.)、「キンギョの変異体の表現型多様性を作り上げる分子機構の理解」(Current Biol.)、「植物二次代謝経路のゲノム進化に学ぶ生合成デザイン」(Nature Comm.)など広い分野でのレベルの高い成果が含まれている。拡大班会議や情報解析講習会はオンサイト開催が必要なためにコロナ禍の中で見送ったが、WEB開催としたヒトゲノム研究倫理を考える会は5回開催し、各回約500名が参加した。 ②大規模配列解析拠点ネットワーク支援活動においては、最先端技術を支援に提供するとともに、染色体レベルの高精度ゲノム配列決定、シングルセル・空間遺伝子発現解析等の支援技術高度化を進めた。 ③高度情報解析支援ネットワーク活動では、支援から浮かび上がった課題を解決するソフトウェアの開発を進め、実際の課題への適用を進めた。2020年度には、超高速相同性検索ソフトウェアPZLASTの開発、Hi-Cデータを使ったゲノムアセンブリソフトウエア、ロングリードシミュレータPBSIM2の開発などを進め、②と合わせて24報の論文を発表した。

p53経路の破綻による腫瘍悪性化の分子基盤の解明とその制御への応用

基盤研究(C)

研究期間:

2013年04月

-

2017年03月

 

時野 隆至

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新規p53標的遺伝子FOXF1およびICAM2についての機能解析を行った。この２つの標的遺伝子は細胞運動・浸潤を阻害し、発現抑制は細胞運動・浸潤を活性化した。p53ががん細胞の浸潤・転移に関与する標的遺伝子を転写制御していることを示唆している。 p53はmiR-200ファミリーを介してがん遺伝子CRKLの発現を抑制した。CRKL強制発現は腫瘍細胞の増殖・浸潤能を促進した。p53がmiRNA転写制御を介して腫瘍細胞の増殖・浸潤に関与するがん遺伝子の発現を抑制することを明らかにした。したがって、p53経路に異常のあるがんに対してCRKLを分子標的とした治療薬が有効なことを示唆する研究成果を得た。

バイオインフォマティクスを活用したp53ネットワーク探索と癌治療への応用

新学術領域研究(研究領域提案型)

研究期間:

2013年04月

-

2015年03月

 

時野 隆至

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p53結合モチーフ認識アルゴリズムを利用して，全ヒトゲノム配列探索により約64万のp53モチーフを同定した。アデノウイルスベクターでp53を発現させた肺がん細胞H1299における次世代シーケンサーを用いたクロマチン免疫沈降解析（ChIP-seq）によるピークと重複するものが20.0%であった。その内約半数は遺伝子間に存在することから，遺伝子介在性非コードRNA (lincRNA) がp53の標的となっている可能性が高いと考えられた。データベースに登録されている約14,000のヒト lincRNA のうち，その上下流10kbにp53モチーフと重複するChIP-seqピークを持つlincRNAを抽出した。qRT-PCRにより発現解析を行ったところ，23個のlincRNAがp53によって転写誘導されることを確認した。 さらに機能的解析により，このうち特定のp53標的lincRNAの発現抑制がp53関連アポトーシス誘導を調整したり，特定の遺伝子群の発現を促進したりする結果を得ることができた。この結果は，腫瘍抑制を含めた多様な生理的機能においてp53とlincRNAが複雑な転写ネットワークを形成していることを示唆している。今後はこのようなp53の基礎的研究から新たな診断法やがん治療開発への臨床応用につながる研究をめざしたい。

MDM4-p53相互作用を分子標的とした革新的ながん治療製剤の探索

挑戦的萌芽研究

研究期間:

2011年

-

2012年

 

時野 隆至, 古畑 智久

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p53経路の不活性化はヒトの発がん機構に共通に見られる特徴であり、p53経路のがん遺伝子MDM4による負の制御を阻害することは、p53経路の再活性化につなかる。本研究は、MDM4-p53結合を競合的阻害する新規の標的分子を探索する目的とする。本研究では12-merペプチドのファーファージディスプレイ ライブラリーを利用して1次スクリーニングを行い、p53-MDM4結合を阻害する新規のペプチドを探索した。その構造にもとづき、より高親和性を有することが予測されるペプチドを複数合成し、MDM4-p53結合を阻害する標的ペプチドを単離した。

がん研究分野の特性等を踏まえた支援活動

新学術領域研究(研究領域提案型)

研究期間:

2010年04月

-

2016年03月

 

今井 浩三, 中村 祐輔, 井上 純一郎, 中村 卓郎, 石川 冬木, 山村 研一, 荒木 喜美, 八尾 良司, 高野 洋志, 高倉 彰, 加藤 秀樹, 中潟 直己, 豊國 伸哉, 鰐渕 英機, 小川 勝洋, 三森 国敏, 山田 泰広, 渋谷 淳, 今井田 克己, 二口 充, 神田 浩明, 田中 英夫, 若井 建志, 三上 春夫, 鈴木 貞夫, 三浦 克之, 渡邊 能行, 有澤 孝吉, 田中 恵太郎, 嶽崎 俊郎, 古庄 憲浩, 内藤 真理子, 大中 佳三, 喜多 義邦, 栗木 清典, 玉腰 暁子, 江口 英孝, 久保 充明, 浜島 信之, 永田 知里, 樋野 興夫, 田原 栄俊, 椙村 春彦, 津金 昌一郎, 中杤 昌弘, 高山 哲治, 赤座 英之, 高橋 悟, 塚本 泰司, 内藤 誠二, 舛森 直哉, 横溝 晃, 並木 幹夫, 藤本 清秀, 藤岡 知昭, 堀江 重郎, 森 満, 森脇 久隆, 清水 雅仁, 神奈木 真理, 石田 高司, 松岡 雅雄, 山岡 昇司, 田中 勇悦, 渡邉 俊樹, 安井 寛, 土屋 永寿, 醍醐 弥太郎, 宮城 洋平, 高橋 隆, 矢守 隆夫, 清宮 啓之, 上原 至雅, 吉田 稔, 井本 正哉, 深澤 秀輔, 掛谷 秀昭, 旦 慎吾, 冨田 章弘, 川田 学, 長田 裕之, 松浦 正明, 水上 民夫, 馬島 哲夫, 牛嶋 大, 時野 隆至, 鈴木 拓, 篠村 恭久, 能正 勝彦, 宮園 浩平, 稲澤 譲治, 広田 亨, 野田 哲生, 鈴木 操, 竹田 直樹, 柳沼 克幸, 杉谷 善信, 伊藤 秀美, 細野 覚代, 岩崎 基, 永瀬 浩喜, 西夛 裕樹, 古野 純典, 橋本 修二, 山口 一成, 高野 淳, 寺本 晃治, 松田 浩一, 田中 祐吉, 青木 一郎, 長村 義之, 中村 直哉, 鈴木 登, 田尻 道彦, 川崎 隆, 横瀬 智之, 柳澤 聖, 平川 晃弘, 飯島 祥彦, 前佛 均, 佐々木 泰史, 井戸川 雅史, 丸山 玲緒, 甲斐 正広

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がんの克服を目指す研究への支援から始まり、平成26 年度からは広く生命科学研究に携わる研究者も対象として支援を展開した。その結果、総括支援活動では若手研究者の育成ならびに今後研究支援に携わる可能性のある人材を育成し、国際学術交流を展開した。遺伝子改変マウスの供給支援、がん組織をはじめバイオリソースの提供支援等により、多くの世界的・先端的研究が展開された。日本を代表する疫学・ATL 研究では、得られた貴重な試料は11万検体を超え、多くの研究者を支援し貴重な成果を生み出した。化学療法基盤支援、ゲノム・エピゲノム支援は当初の目標を上回る成果を上げた。さらに市民講演会等により国民に支援の重要性を広報した。

口腔癌におけるSFRP遺伝子の発現解析と分子標的の開発

若手研究(B)

研究期間:

2009年

-

2010年

 

曽我部 陽平, 荻 和弘, 平塚 博義, 時野 隆至

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本研究は口腔扁平上皮癌(OSCC)におけるSFRP遺伝子のエピジェネティックな不活化とWntシグナル経路関連因子の異常について解析したものである。本研究はOSCCにおけるSFRP遺伝子群のメチル化と発現消失を初めて明らかにした。OSCCにおいて他のWntシグナル関連遺伝子異常は稀であることから、SFRP遺伝子メチル化はWntシグナル活性化の要因の一つと考えられる。SFRPはOSCCの診断・治療において重要な分子マーカーとなりうることが示唆された。

RNA干渉技術を駆使してアポトーシス誘導シグナルを増強した遺伝子治療法の開発

挑戦的萌芽研究

研究期間:

2009年

-

2010年

 

時野 隆至, 古畑 智久

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癌抑制遺伝子p53の導入による遺伝子治療が有効であると考えられるが、必ずしも著効するとは限らず、さらなる工夫が必要である。これまでに、我々はp21発現抑制miRNA/p53共発現アデノウイルスベクター(Ad-p53/miR-p21)を開発することで癌治療効果を増強することに成功した。そこで、更に別の標的遺伝子のひとつであるMDM2を特異的に発現抑制する人工miRNAの設計を行った。この設計配列を元に4種類のDNAオリゴを合成し発現プラスミドベクターに組み込んだ。このベクターをp53発現ベクターと共に大腸癌細胞HCT116にトランスフェクションしたところ、p53が強発現しているにもかかわらずMDM2の蛋白発現誘導の抑制が認められた。次に、相同組み換えを用いて、このベクターをアデノウイルスベクターAd-miR-MDM2を作成した。このアデノウイルスベクターをAd-p53/miR-p21と共に大腸癌細胞DLD-1に感染させたところ、MDM2の発現抑制によりp53の発現上昇と、それに伴うアポトーシスの増強効果が認められた。肝癌細胞Hep3Bおよび大腸癌細胞SW480にアドリアマイシンを併用した場合においても、miR-MDM2はAd-p53/miR-p21によるアポトーシス誘導を増強した。 本研究において、p53発現ベクターにp21抑制miRNAおよびMDM2抑制miRNAベクターを併用することでアポトーシス増強効果を得ることに成功した。miRNA発現ベクターは、他のmiRNAをタンデムに接続することで複数の標的遺伝子の発現を抑制することが可能である。このため、他のアポトーシス阻害的な遺伝子に対するmiRNA設計し、複数を組み合わせることで相乗効果を得ることができる。この研究成果により、更なるp53遺伝子治療効果の増強および治療耐性の回避が期待できる。

細胞分裂制御遺伝子CHFRの機能解明および口腔癌の診断・分子標的薬の開発への応用

基盤研究(B)

研究期間:

2008年

-

2010年

 

時野 隆至, 平塚 博義, 荻 和弘

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癌抑制遺伝子CHFRは細胞周期M期チェックポイント機能を有し、E3ユビキチンリガーゼをコードするが、その標的基質分子および制御機構は不明な点が多い。本研究では、CHFR結合分子としてPARP-1を同定し、CHFRがこの標的分子である1本鎖切断DNA結合性のDNA 修復関連タンパクPARP-1のポリユビキチン化およびタンパク分解を介してM期チェックポイントを制御していることを突き止めた。またChfr欠損マウスおよびヒト口腔癌由来の細胞においてPARP-1タンパクレベルが有意に上昇していることを確認した。本研究はタキサン系抗癌剤抵抗性メカニズムの解明に貢献し、この抵抗性を示す口腔癌細胞において微小管阻害剤とPARP阻害剤とが有効な併用効果をもたらす分子機序を提唱する。

デジタル ゲノム スキャニング法の開発と胃癌関連遺伝子探索への応用

萌芽研究

研究期間:

2007年

-

2008年

 

時野 隆至, 古畑 智久, 見田 裕章, 明石 浩史

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癌遺伝子の増幅や癌抑制遺伝子の欠失を伴う染色体変化は癌細胞の特徴である.本研究では短いゲノム断片を解析しゲノム上のDNAコピー数以上を示す領域を検出する方法としてデジタルゲノムスキャニング(DGS: Digital Genome Scanning)法を開発し,胃癌細胞株におけるゲノムコピー数異常の検出を試みた. DGS法を利用して,ヒト胃癌細胞株においてKRASCACNAIC (calcium channel, viltage-dependent, 1 type, alpha-1c subunit)を含む2つの約500kbのゲノム領域を染色体12p12.1と12p13.33に同定した.KRAS遺伝子増幅を有する胃癌細胞株では,KRASのmRNAおよびタンパクレベルはKRAS遺伝子コピー数とよく相関していた.正常型KRASが遺伝子増幅した胃癌細胞では,血清刺激後に高レベルのGTP-KRASおよびリン酸化p44/42が検出された.一方,変異型KRASが遺伝子増幅した別の胃癌細胞では,恒常的に高レベルの活性型KRASおよびp44/42が検出された.この結果は,細胞増殖において正常型KRASの遺伝子増幅が無刺激条件下で選択優位性をもたらすのみならず,増殖因子刺激や高栄養環境の条件では点変異KRAS遺伝子と同様に著しい選択優位性を獲得可能なことを強く示唆している. 以上より,DGS法は癌を代表とするゲノムコピー数異常を呈する疾患の原因遺伝子探索において有効な手法となりうることを実証した.

細胞分裂制御遺伝子を分子標的とした口腔癌の診断と治療への応用

基盤研究(B)

研究期間:

2006年

-

2007年

 

時野 隆至, 平塚 博義, 荻 和弘

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1.CHFRと相互作用するタンパクの同定・解析 CHFRはRINGドメインを有するE3ユビキチンリガーゼであり、細胞が微小管阻害剤に暴露された際に染色体凝縮を遅らせる機能をもつ、新規の有糸分裂期チェックポイント分子であるが,がん細胞の微小管阻害剤感受性を規定するCHFRの生理的機能やその分子機構についての詳細は不明である。本研究では、CHFRの分子機能を明らかにする目約で、酵母ツーハイブリッド法を用いたCHFRの結合タンパクの同定を行った。その結果、標的の分解を誘導する一般的なE2ユビキチン結合酵素に加え、標的の分解を誘導しないE2酵素群がCHFR結合タンパクとして単離された。一方、CHFRのFHAドメインに結合する新規タンパクとしてgadd34が同定された。ドセタキセル存在下においてCHFRの一部は核から細胞質へ移行することによってgadd34と共局在し、このCHFRの局在変化の後に細胞死が誘導された。これらの結果は、gadd34とCHFRが分裂期ストレスに反応して協調的に細胞死を起こす機能を持っていることが示唆された。 2.CHFRがNF-kBシグナル経路に及ぼす阻害的効果 次にCHFRによる転写制御に着目し、マイクロアレイ解析によりCHFRがNF-kBシグナル経路の制御に関わっていることを見出した。NF-kBの標的分子の一つであるIL-8が、CHFRにより制御されていることを見出した。IL-8のmRNAおよびタンパク質レベルは、CHFRの過剰発現により有意に抑制された。CHFRを過剰発現させた大腸癌細胞株HCT116細胞の培養上清でヒトさい帯静脈血管内皮細胞を処理すると、HUVECの遊走が減少した。本研究は、NF-kBシグナル伝達系の制御分子としてのCHFRの機能を初めて示すものであり、この機能によりCHFRが口腔癌の抑制に寄与している可能性が示唆された。

p53遺伝子ファミリーの機能解析とがん治療への応用

特定領域研究

研究期間:

2005年

-

2009年

 

時野 隆至

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ゲノムインフォマティクスを利用した新規p53標的遺伝子の予測は、発現解析との組合せによって新規標的遺伝子の同定に有用なこと明らかにした。マイクロアレイを利用したp73およびp63特異的標的遺伝子の検索を行い、新たにPEDF、FLOT2およびAPODなどの同定に成功した。p53ファミリー組換えアデノウイルスは、マウスモデルでの骨肉腫に対する遺伝子治療においてp53に比較して強力な腫瘍抑制効果を得た。また、p53とヒストン脱アセチル化酵素阻害剤FK228との併用効果もマウスモデルにおいて明らかにした。

p53遺伝子ファミリーの機能解析とがん治療への応用

研究期間:

2005年

-

2009年

 

時野 隆至

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p53遺伝子治療とヒストン脱アセチル化酵素阻害剤FK228との併用効果の検討 p53遺伝子治療の奏効率を高めるためには,p53依存性アポトーシス誘導に抵抗性の癌を克服する必要がある。最近,ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤(HDACI:histone deacetylase inhibitor)には細胞周期停止や細胞死誘導効果が報告されており,腫瘍細胞の増殖を抑制する新規の抗がん剤として注目されている。また,白血病などで第2相臨床試験が行われている天然化合物HDACIのFK228(depsipeptide)はCAR(coxsackievirus adenovirus receptor)の発現を増強させることによって,アデノウイルス感染を促進することが報告されている。 本研究では,腫瘍細胞の増殖抑制におけるFK228前処理とAd-p53遺伝子導入の相乗効果を,細胞レベルおよびマウスモデルで検討した。その結果,FK228前処理はCARの発現増強を介してAd-p53感染効率を2-5倍増加させることによって,癌細胞のアポトーシス誘導を増強した。また,FK228はp53タンパクのアセチル化も促進し,その結果Noxaの発現誘導を特異的に増加させた。さらに,FK228とAd-p53との併用は,Baxタンパクのミトコンドリアへの移行を促進した。アポトーシス誘導におけるFK228とAd-p53の相乗効果は,siRNAを用いたNoxaとBaxのノックダウンによって顕著に阻害された。ヌードマウスin vivo皮下移植モデルにおいて,p53遺伝子導入単独では増殖抑制の見られなかった癌細胞株においても,FK228との併用によってアポトーシスが誘導され,増殖抑制効果が認められた。本研究により,FK228はp53遺伝子治療との併用薬剤として有望と考えられる。

デジタルゲノムスキャニング法の開発と消化器癌関連遺伝子探索への応用

萌芽研究

研究期間:

2005年

-

2006年

 

時野 隆至, 古畑 智久

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癌遺伝子の増幅や癌抑制遺伝子の欠失を伴う染色体変化はがん細胞の特徴である.本研究では短いゲノム断片を解析しゲノム上のDNAコピー数以上を示す領域を検出する方法としてデジタルゲノムスキャニング(DGS: Digital Genome Scanning)法を開発し,胃癌細胞株におけるゲノムコピー数異常の検出を試みた. 胃癌細胞株ゲノムDNAを制限酵素処理した断片を回収し,連結したクローニングしたDNA断片の塩基配列を決定した.取得した塩基配列をヒトゲノム上にマップし,ゲノム上での断片の分布密度をもとにコピー数異常を示す領域を推定した.DGSで予測されたゲノム増幅領域に存在する癌遺伝子の候補については,次に,Southern blot, FISH, real-time RT-PCR, Western blot法などの分子生物学的手法で検証を行った.このDGS解析により,胃癌細胞株の第12番染色体短腕約0.5Mbのゲノム増幅が同定され,同領域に存在する癌遺伝子K-rasのゲノム増幅を確認した.K-ras領域のゲノム増幅は胃癌細胞株18種中4種で,また臨床胃悪性腫瘍50例中4例で検出された.また,K-rasの遺伝子増幅を示した胃癌細胞株ではMAP kinase(ERK1/2)の恒常的活性化が観察された. 以上より,DGS法はがんを代表とするゲノムコピー数異常を呈する疾患の原因遺伝子探索において有効な手法となりうることを実証した.

有糸分裂チェックポイント遺伝子CHFRの口腔癌診断・治療への応用

基盤研究(B)

研究期間:

2004年

-

2005年

 

時野 隆至, 平塚 博義, 木戸 幸恵, 田中 信幸

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細胞周期チェックポイント機能における変異は口腔扁平上皮癌で頻繁に検出される。そしてそれはしばしば化学療法剤に対する癌細胞の感受性と関連することが明らかにされた。近年、様々なヒト癌細胞におけるマイトティックチェックポイント遺伝子CHFRはプロモーター領域のメチル化や点突然変異により遺伝子機能が不活化されることが報告されてきた。CHFRの機能の欠失はマイトティックチェックポイント機能不全に関連しており、このことは癌細胞で微小管重合阻害剤に対して感受性が高くなることを示している。 本研究においては,CHFRの機能を欠失すると口腔癌細胞株ではヒストンH3のセリン10のリン酸化が引き起こされ、またcyclin B1の核移行の際には、分裂期の欠失によってチェックポイントの損傷が引き起こされることを明らかにした。CHFRの機能を欠失した口腔癌細胞株を微小管重合阻害剤(docetaxelまたはpaclitaxel)で処理したところ、アポトーシスを起こした細胞数はかなり増加した。さらにsiRNAにより遺伝子機能を障害した場合CHFRの分裂が障害された。それは口腔癌細胞株でG2/M期において細胞死させる機能が低下し、結果として微小管重合阻害剤感受性が高くなることを示唆する。本研究はCHFRが化学療法剤感受性に関する分子標的として有用性があることを示した。

p53転写制御因子ファミリーの細胞分化における役割

特定領域研究

研究期間:

2004年

-

2005年

 

佐々木 泰史, 時野 隆至

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p53転写制御因子ファミリー(p53,p73,p63)は多彩な機能を有している.p53が代表的な癌抑制遺伝子であるのに対し,p63は,外胚葉性器官の発生や分化に,またp73は神経系の発生,炎症,アレルギーに関与していることが明らかになっている.我々もこれまでにp63およびp73がNotchシグナルを活性化できること,またp73がIL-4シグナルを介してT細胞の分化に関与していることを明らかにしてきた.本研究ではこれらの知見をさらに押し進め,p53ファミリーがどのような機構で増殖,分化,アポトーシスに関与しているかを明らかにすることを目標とし,以下の成果をあげた. 1)p73,p63に特異的な標的遺伝子としてpigment epithelium derived factor(PEDF)を同定した。PEDF遺伝子のプロモーターにはp73,p63に特異的な応答性配列が認められ,PEDFの発現はp73またはp63によって誘導されたが,p53では誘導されなかった.また,p73を強制発現させたヒト大腸癌細胞株の培養上清を骨由来細胞に添加したところ,細胞の分化を誘導した.この効果はPEDFに対する中和抗体によって阻害されたことより,PEDFがp73,p63の下流で細胞分化に関わっていることが示唆された。 2)p73,p63に特異的な標的遺伝子として細胞膜raftの主要構成分子をコードするflotillin-2を同定した.flotillin-2遺伝子のプロモーターにはp73,p63に特異的な応答性配列が認められた.さらに,p63を強発現させた細胞ではIL-6のシグナル経路が活性化しており,その効果はflotillin-2のsiRNAによって阻害された.以上の結果はp63あるいはp73がflotillin-2の発現調節を介して,細胞分化,炎症に関わっていることを示唆している. 3)ゲノムデータベースからのp53ファミリーに特異的な結合配列を抽出し,その近傍の遺伝子を解析した.その結果vitamin D receptor遺伝子など,p53ファミリーの機能を媒介し直接実行する標的遺伝子を同定した.

卵巣癌におけるエピジェネティクスの異常の解析と治療への応用についての研究

基盤研究(C)

研究期間:

2003年

-

2005年

 

藤井 美穂, 寒河江 悟, 豊田 実, 時野 隆至

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MCA法による新しい遺伝子の同定:卵巣癌細胞株を用いMCA(methylated CpG island amplification)法により、正常細胞とでサブトラクションを行うことにより、卵巣癌での異常メチル化している多数の遺伝子を同定した。これは卵巣癌に抑制的に働く新たな遺伝子の発見につながるもので、現在遺伝子データベースを利用し各遺伝子について検討している。同時に各遺伝子のエピジェネティクな異常と卵巣癌での分子生物学的特徴について検討中である。 TCF2遺伝子についての解析:上記のMCA法により、メチル化によりサイレンシングしている遺伝子の一つとしてTCF2遺伝子を同定した。TCF2は細胞の分化に関与する転写因子であり、各種腫瘍において発現異常が報告されている。実際卵巣癌ではTCF2遺伝子のメチル化は、卵巣癌細胞株16例中8例(50%)、卵巣癌症例68例中16例(23.5%)に認めた。メチル化を認める細胞株においては、発現の低下あるいは消失を認め、DNAメチル化阻害剤により遺伝子の再発現を認めた。また、プロモーター領域のヒストン脱アセチル化を認め、メチル化による遺伝子発現抑制にヒストン修飾が関与することが示唆された。さらに組織型別では明細胞性腺癌ではメチル化による抑制は少なく高頻度な発現が認められた。これは卵巣癌の中でも予後不良な明細胞性腺癌の生物学的解明につながる可能性がある。(投稿中) 癌での細胞周期M期の制御の解析:これまで細胞周期M期に関わる遺伝子の異常と微小管阻害剤の感受性を検討してきた。ドセタキセルを暴露させたMitotic Indexの高い細胞株は抗癌剤に高い感受性を示し、CyclinBの核への集積が認められた。発現を調節している分子としてBUB1,MAD, Auroraなどの分子について検討中である。さらにCHFR遺伝子を細胞株に導入することによって、M期での分子制御機構の解明や抗癌剤の感受性の変化についても検討中である。

遺伝子あるいは発現プロテオミクス解析を用いた婦人科癌抗癌剤耐性の分子標的の研究

基盤研究(C)

研究期間:

2003年

-

2005年

 

寒河江 悟, 寺澤 勝彦, 時野 隆志, 工藤 隆一

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寒河江、寺澤らは、Paclitaxel, Docetaxel、新規抗癌剤Oxaliplatinに対してそれぞれ感受性のある細胞株、それらに対する耐性株を用いて、これら細胞株に一定時間、各種抗癌剤を暴露した後、その投与前後における薬剤耐性関連遺伝子群発現のパターンの変化をcDNAアレイなどを用いて検討した。現在、CDDP、Paclitaxel、Docetaxel、254-Sに対するCDDP、Paclitaxel感受性株、耐性株の薬剤投与前後のアレイパターンを解析して、それぞれの薬剤、細胞株に特異的な遺伝子群を検討し、薬剤耐性の機序を解析している。 さらに寒河江、寺澤らは、蛋白レベルでの検討のため手術摘出物より極力プロテオリーシスの起きない状況下で蛋白サンプルを採取し、これを電気泳動により展開し、蛋白レベルでの抗癌剤耐性に関与する蛋白の変化をmRNAレベルでの変化と比較検討した。また蛋白質を2-D電気泳動で展開、分離し、2-Dマップを作製、薬剤毎、抗癌剤感受注毎にデータベース化を試みている。今後、こうしたDifferential proteomic displayにより、変化のあったスポットを酵素消化後、質量分析計あるいはシークエンサーにて同定を試みる予定である。これにより、各薬剤毎に薬剤感受性、耐性に関与する蛋白、特にアポトーシス関連蛋白を選定し、同蛋白に対する抗体の作製、及び同抗体の抗癌剤感受性及び耐性に及ぼす影響の実験の基礎としたいと考えている。