Research Projects -

脂肪滴の細胞質および核内での生理機能解明

基盤研究(B)

Project Year :

2024.04

-

2027.03

 

大崎 雄樹, 和田 亘弘

核内脂肪滴の肝疾患における意義

Project Year :

2023.04

-

2025.03

 

大﨑雄樹

Authorship： Principal investigator

脂肪滴の核内での形成機構と生理機能の形態学的解析

Project Year :

2023.04

-

2025.03

 

大﨑雄樹

Authorship： Principal investigator

核膜変形機構と核内脂質代謝の細胞老化への影響の解明

Project Year :

2023.04

-

2024.03

 

大﨑雄樹

Authorship： Principal investigator

脂肪滴による核内蛋白質機能制御機構の解明

Project Year :

2022.08

-

2027.05

 

大﨑雄樹

Authorship： Principal investigator

Elucidation of nuclear lipid droplet functions

Grant-in-Aid for Scientific Research (A)

Project Year :

2022.04

-

2025.03

 

藤本豊士, 大﨑雄樹, 辻琢磨

Authorship： Coinvestigator(s)

核内脂肪滴の新規生理機能

基盤研究(C)

Project Year :

2021.04

-

2024.03

 

大崎 雄樹

　View Summary

コレステロールエステル（CE）とトリアシルグリセロール (TAG)から成る中性脂質をリン脂質一重膜が覆う構造である脂肪滴は、通常小胞体膜から形成される細胞質オルガネラであるが、我々は肝由来細胞では脂肪滴が核膜陥入構造と近接し、タンパク質修飾や遺伝子発現制御に関与するPML小体と複合体を形成して存在すること、核内脂肪滴は小胞体内腔の中性脂質顆粒であるリポプロテイン前駆体に由来し、ホスファチジルコリン（PC）合成を活性化させて小胞体ストレスを軽減する装置として働き得ることを以前に報告した。一方核内脂肪滴は非肝由来細胞でも形成されることから、細胞の種類を問わないユニバーサルな形成機序の存在が示唆されていた。 本計画において今年度はまず非肝由来細胞における新規の核内脂肪滴形成機序を探索した結果、内核膜には本来小胞体に局在する脂質合成酵素群が存在し、核内で直接、中性脂質合成と脂肪滴形成が行われることを明らかにした。さらに細胞質脂肪滴の形成に重要な小胞体膜貫通タンパク質Seipinが、ジアシルグリセロール (DAG)合成酵素であるLipin1 betaの転写を抑制することで核内脂肪滴の形成を負に制御することを見出した。これらの成果は国際学術誌および国内学会において報告した。 一方、核膜の変形を司る分子候補Tの発現量と核内脂肪滴および核膜陥入構造（NR）の形成とが逆相関することを見出した。さらに肝疾患疑い患者の肝生検試料の電顕観察により、人の肝細胞内で実際に核内脂肪滴が頻繁に形成されることが判明した。 他方核内脂肪滴の生理的意義の解明については、一部の脂肪酸結合タンパク質が核内脂肪滴に局在し、がん形成促進因子の転写を制御することを見出した。また一部のDNA損傷修復系分子が核内脂肪滴に局在することを見出した。

Studies on the function of the lipid droplet surface

Grant-in-Aid for Scientific Research (A)

Project Year :

2018.04

-

2021.03

 

Fujimoto Toyoshi

　View Summary

The surface of lipid droplets (LDs) has properties different from other biological membranes and recruit unique proteins. In hepatocytes exposed to the endoplasmic reticulum stress, we discovered that lipids, which are normally secreted as lipoproteins, enter the nucleus and generate nuclear LDs. These nuclear LDs recruit and activate CCTα, an isoform of the enzyme critical for phosphatidylcholine synthesis, thereby contributing to mitigation of the endoplasmic reticulum stress. In cells under starvation, free fatty acids derived from digested self materials generate cytoplasmic LDs. On those LDs, CCTβ3, a different isoform of CCT, is activated, and this helps cells to maintain autophagy and survive for a prolonged time in starvation.

Functional interaction of nuclear lipid droplets and invagination of nuclear membrane

Grant-in-Aid for Scientific Research (C)

Project Year :

2018.04

-

2021.03

 

Ohsaki Yuki

　View Summary

Lipid droplets (LD), composed of neutral lipids and a phospholipid monolayer, are formed not only in the cytoplasm but in the nucleoplasm in some types of cells. The purpose of this research is to clarify biogenesis mechanism and functions of nuclear LD. We found in hepatic cells, lipoprotein precursors excessively formed in the ER lumen can be spread through the continues luminal space of nuclear membrane as well as nucleoplasmic reticulum (NR), an invagination of inner nuclear membrane, then the luminal precursors become nucleoplasmic LDs after partial rupture of NR membrane. We also found that nuclear LDs are more formed particularly under ER stress, and the surface of nuclear LDs function as a platform in which CCTalpha, a rate-limiting enzyme of de novo phosphatidylcholine (PC) synthesis, is activated and cellular PC synthesis is upregulated. Further, we identified that PLIN3 can bind to nuclear LDs competitively with CCTalpha and work as an endogenous inhibitor of PC synthesis.

Cell biological studies on membrane lipid distribution and dynamics

Grant-in-Aid for Scientific Research (A)

Project Year :

2015.04

-

2018.03

 

Fujimoto Toyoshi, YAMAMOTO HAYASHI, TAGUCHI TOMOHIKO, TAKATORI SHO

　View Summary

Electron microscopic methods to label phosphatidylinositol 3,5-bisphosphate, phosphatidylinositol 3,4-bisphosphate, and phosphatidylserine by quick-freezing and freeze-fracture replica labeling were established and distribution of respective phospholipids were defined at the nanometer scale. Involvement of PML-II in formation of nuclear lipid droplets was found and close relationship between nuclear lipid droplets and PML nuclear body as well as nucleoplasmic reticulum, which is an extension of the nuclear envelope, was shown. Microautophagy of lipid droplets that occurs in budding yeast at stationary phase and in acute nitrogen starvation was shown to proceed in a raft-like membrane domain of the vacuole membrane and Niemann-Pick type C proteins were found to play a critical role in transportation of sterol to generate the membrane domain.

Physiological meanings of nuclear lipid droplets

Grant-in-Aid for Scientific Research (C)

Project Year :

2015.04

-

2018.03

 

Ohsaki Yuki, JOKITALO Eija

　View Summary

Lipid droplets (LD) are composed of a neutral lipids core and phospholipids monolayer. In hepatic cells, LDs are formed not only in the cytoplasm but in the nucleus. The aim of this research is to clarify biogenesis and physiological roles of nucleoplasmic LDs. Morphological analyses showed that lipoprotein precursors in the lumen of the endoplasmic reticulum (ER) can be delivered to the lumen of nucleoplasmic reticulum (NR), an invagination of inner nuclear membrane, then finally transferred to become nucleoplasmic LDs. Moreover, CCTalpha, the rate-limiting enzyme of de novo synthetic pathway of phosphatidylcholine (PC), was recruited to nucleoplasmic LDs, which correlated to increase of PC synthetic activity. These data suggested that nucleoplasmic LDs function as a site of CCTalpha activation, which can regulate cellular PC synthesis and ameliorate ER stress.

Mechanism to generate lipid-based supramolecular structures

Grant-in-Aid for Scientific Research (B)

Project Year :

2012.04

-

2015.03

 

FUJIMOTO Toyoshi, OHSAKI Yuki, SUZUKI Michitaka

　View Summary

We studied on lipid-based supramolecular structures, i.e., lipid droplet, autophagosome, and lipid domain. The results obtained are as follows: 1) In mice lacking a lipid droplet-resident protein, UBXD8, in liver, hepatocytes are deficient in lipoprotein secretion and exhibit an atypical type of steatosis; 2) Phosphatidylinositol 3-phosphate, a phospholipid indispensable for autophagy, takes drastically different distributions in autophagosomes between budding yeast and mammalian cells; 3) Distribution of phosphatidylcholine across the plasmalemmal lipid bilayer is different between budding yeast and mammalian cells.

脂肪滴と細胞内蛋白質分解メカニズムの機能的相関

若手研究(B)

Project Year :

2009.04

-

2010.03

 

大崎 雄樹

　View Summary

肝癌由来細胞株Huh7では脂肪滴(LD)-小胞体(ER)融合構造(ApoB-crescent)がプロテアソーム,オートファジー阻害剤処理等により増加する.21年度は以下の様に研究を進めた(到達目標項目別に列挙). 1. 脂肪滴-小胞体融合構造がApoBの特殊な分解装置として機能する事の立証. Hun7から精製した脂肪滴画分のプロテオーム解析によりユビキチン化関連分子群が多数同定された. (1) Huh7細胞(一部はクローニングした各分子を一過性発現)からショ糖密度勾配遠心により回収した脂肪滴画分中に各分子が局在する事を特異的抗体/エピトーグタグ抗体を用いて再確認した. (2) 候補分子のうち2種(A,B)の発現をRNAiにより抑制すると,細胞内ApoB量及びApoB分泌量が減少した. (3) 別の2分子(C,D)の発現抑制により,脂肪滴蛋白質であるADRP量,及び脂肪滴数が増加した. ApoB,ADRPのユビキチン化,蛋白質寿命等を解析し,それぞれの分解に寄与する分子複合体の同定を目指す. 2. 脂肪滴周囲におけるApoB-VLDL代謝とヒトC型肝炎ウイルスHCV複製機構の関連の解明. HCV粒子産生・分泌過程はApoB-VLDLの生合成/分泌過程と相関する. (4) Huh7.5細胞:HCV-JFH1株を用いたHCV産生培養系を利用して,小胞輸送障害剤あるいはADP-リボシル化阻害剤処理(ApoB-crescent及びApoB分泌を抑制する;未発表)により感染性HCV粒子形成量が減少する事を確認した.今後は項目1の候補分子群を抑制した細胞培養系において感染性HCV粒子形成率を評価する.

Cell Biological Analysis of Lipidic Supramolecular Structure

Grant-in-Aid for Scientific Research (B)

Project Year :

2009

-

2011

 

FUJIMOTO Toyoshi, OHSAKI Yuki, SUZUKI Michitaka, FUJITA Akikazu

　View Summary

(1) We found that lipidated ApoB is dislocated from the ER lumen to the lipid droplet surface for proteasomal degradation and that UBXD8 and Derlin-1 are critically involved in the mechanism. Derlin-1 is engaged in the dislocation step, whereas UBXD8 functions after the dislocation. The result elucidated the molecular mechanism of ApoB degradation process that occurs on the lipid droplet surface. (2) We demonstrated the nanoscale distribution of phosphatidylinositol 4, 5bisphosphate[PI(4, 5) P2] by the quick-freezing, freeze-fracture replica labeling method. The following findings were obtained : in cultured fibroblasts, PI(4, 5) P2 is concentrated at the orifice of caveolae and coated pits and shows different behaviors from that in the flat undifferentiated membrane region ; in rat pancreatic epithelial cells in vivo PI(4, 5) P2 was found densely distributed in the gap junction.

脂肪滴に局在する蛋白質分解機構の解析

特定領域研究

Project Year :

2009

-

2010

 

藤本 豊士, 藤田 秋一, 鈴木 倫毅, 大崎 雄樹

　View Summary

肝細胞における超低比重リポ蛋白質(VLDL)形成の初期段階では、アポリポプロテインB100(ApoB)の翻訳に同期して脂質成分が付加され、脂肪滴がこの際の脂質を供給することが知られている。我々はこれまでの研究により、脂肪滴が、脂質付加されたApoBがプロテアソームやオートファジーで分解される足場ともなることを見だした。またこれらの蛋白質分解系を阻害すると、脂肪滴の周囲にユビキチン化したApoBが蓄積する特異な構造(ApoB-crescent)が出現することも明らかにした。プロテアソームで分解されるためには脂質付加後のApoBが小胞体内腔から細胞質側に輸送される必要がある。今回の研究ではその分子機構を明らかにするため、ApoB-crescentを大量に含む脂肪滴を精製し、質量分析法によるプロテオーム解析で複数の蛋白質分解関連分子を同定した。その内の1つ(X)の機能を阻害すると、脂質付加後のApoBは細胞質側に出ることができなくなり、Xが小胞体内腔から細胞質への逆行輸送に必須の成分であることが示唆された。また、他の蛋白質(Y)の発現を阻害すると、ユビキチン化されたApoBが脂肪滴の細胞質側表面に蓄積し、YがApoBのプロテアソームへの供与に必要であることが明らかになった。X,Yともに機能阻害によって小胞体内腔に脂質付加ApoBが蓄積し、特にYの阻害ではApoB分泌が有意に減少した。これらの結果は脂肪滴が脂質付加後ApoBの逆行輸送と分解の場であり、X,Yがその機構に重要な役割を果たす因子であることを示すものである。

がん細胞の増殖,浸潤機構と脂質ドメイン

特定領域研究

Project Year :

2008

-

2009

 

藤本 豊士, 藤田 秋一, 大崎 雄樹, 鈴木 倫毅

　View Summary

膜脂質の正確な局在をナノメートルレベルで決定することは膜生物学だけでなく,細胞増殖,細胞運動など種々の現象を分子レベルで理解するために重要である。しかし,通常の化学固定剤は脂質に作用せず,また様々な刺激が局在変化を惹起する可能性があるため,膜脂質に関する理解は進んで来なかった。我々は今回の研究により急速凍結と凍結割断レプリカ標識法を組み合わせることにより,膜脂質を物理的に固定し,局在を決定する方法を開発した。その方法を用いて,細胞骨格,小胞輸送などの制御に重要な役割を果たすフォスファチジルイノシトール4,5二燐酸(PIP2)の挙動を明らかにした。PIP2は線維芽細胞の平坦な膜領域ではごく弱いクラスターを形成するのみであったが,カベオラ開口部,コーテッドピット辺縁部には高度な集中を示した。Angiotensin II刺激後,平坦な膜領域では10秒でPIP2標識密度は最低レベルに低下し,2分までに徐々に回復した。カベオラのPIP2は10秒では変化せず,40秒で最も低下し,2分で静止期レベルに回復した。コーテッドピットは10秒でやや減少したが,その程度は平坦な膜領域に比較してごく軽度であった。PIP2の集合は,カベオラではカベオリンに,コーテッドピットではepsin, dynaminなどのエンドサイトーシス関連蛋白質に結合することによって生じると考えられる。今回の結果は,3つの異なる挙動を示すPIP2のプールが形質膜に存在することを明確に示した。本研究で開発した方法は高い空間解像度を持ち,任意の細胞に応用することができる。動物体内の細胞など,多くの実験系への応用が考えられ、癌細胞の挙動解析にも重要なツールとなる。

The lipid droplet-ER fusion structure functions as a platform for protein degradation pathways

Grant-in-Aid for Young Scientists(B)

Project Year :

2007.04

-

2009.03

 

大崎 雄樹

Authorship： Principal investigator

　View Summary

肝癌由来培養細胞株ではApolipoprotein B(ApoB)が脂質滴周囲に蓄積する(ApoB-crescent). プロテアソーム阻害下で同構造の形成は増加し, 同構造内のApoBはユビキチン化されており, 脂質滴とApoB分解機構との関連が疑われた. 形態学的解析からApoB-crescentとはApoB, ERシャペロンを含む特殊なER由来膜が脂質滴に密着した複合体であると判明してきた. 本研究では(1)超微細構造解析, 局在分子決定等により脂質滴－ER複合体の構造的連関を更に明らかにし, (2)脂質滴蛋白質, ERシャペロン, ER形態制御因子等の発現操作を通じて同複合体とApoBのプロテアソーム分解系との機能的連関を明らかにする.

Cell biological analysis of cytoplasmic lipid droplets

Grant-in-Aid for Scientific Research (B)

Project Year :

2007

-

2008

 

FUJIMOTO Toyoshi, FUJITA Akikazuc, OHSAKI Yuki, SUZUKI Michitaka

　View Summary

肝細胞の脂肪滴について次のような成果を得た. (1) プロテアソーム阻害, 多価不飽和脂肪酸投与などにより, 小胞体内腔と細胞質の両方に面する特殊な脂肪滴が出現することを見出し, 脂質エステルが小胞体膜中に蓄積し得ることを明確に示した. (2) 脂質付加後のApolipoprotein Bは小胞体の内腔にあるため, 同分子が細胞質側でプロテアソーム分解を受けるためには特殊な機構が必要であることが示唆された.

Proteins degradation pathways exist around lipid droplets

Grant-in-Aid for Young Scientists (B)

Project Year :

2007

-

2008

 

OHSAKI Yuki

　View Summary

肝細胞では脂質滴(Lipid droplet : LD)由来の脂質とApolipoprotein B (ApoB)とが小胞体で結合して超低比重リポプロテイン(VLDL)が合成される. 本研究は (1)脂肪滴と小胞体の一部(ApoBが貯留する)が融合した構造(ApoB-crescent)がプロテアソーム阻害剤処理時に増加する事, (2)脂質滴画分には多くのプロテアソーム分解系関連因子が存在する事を肝癌由来培養細胞を用いて明らかにし, 脂質滴周辺でのApoB代謝機構の存在を示唆した.

定量的可視化法による癌細胞でのラフト破綻の解析

特定領域研究

Project Year :

2006

-

2007

 

藤本 豊士, 藤田 秋一, 大崎 雄樹

　View Summary

細胞膜ラフトには癌遺伝子産物を含む様々なシグナル伝達関連分子が集積するため、ラフト構造の破綻は細胞分化・増殖の異常の原因となると推測されている.しかしラフトを解析する手段はきわめて限られており,生細胞でのラフトの実体は長く論争の渦中にある.本研究では,微弱な分子間相互作用で形成されている可能性の高いラフトを解析するため,細胞膜分子の動態に人工的な変化をもたらしうる処理やプローブを使わずに解析する方法の開発を進めてきた.本年度の成果は以下の通りである. 1)生化学的にラフトへの集中が推測されていたPI(4,5)P2は平坦な細胞膜では弱いクラスターを形成して存在すること,上記のクラスターはコレステロール抽出でやや低下するが,アクチン脱重合でほぼ完璧に消滅すること,PI(4,5)P2がカベオラ開口部に顕著に集中することなどが判明した.これらの結果は生細胞でのPI(4,5)P2の分布をナノスケールで初めて明らかにしたものであり,カベオラが平坦な細胞膜部分とは異なる特殊な領域を形成することを示した点で重要である. 2)PI(4,5)P2はv-Src発現細胞に形成されるinvadopodium周辺では少なかった.一方,invadopodiumに集積するPI(3,4)P2は細胞膜平面には少なく,おもに細胞骨格成分で構成される領域に分布することが明らかになった.このような結果は従来の方法では得られておらず,癌細胞の浸潤機構に示唆を与えるものである.