Research Projects -

イノシトール燐脂質分布の定量的解析

特定領域研究

Project Year :

2006

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2007

 

藤本 豊士, 藤田 秋一, 大崎 雄樹, 鈴木 倫毅

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ホスファチジルイノシトール(PI)のイノシトール基の3,4,5位が燐酸化されることによって生じるイノシトール燐脂質(PIs)は,細胞内小胞輸送やシグナル伝達に重要な役割を果たすことが知られている.PIsの膜内二次元分布をナノスケールで解析し,細胞内超微構造との関連を明らかにすることはPIsの生理的機能をさらに詳細に理解するために重要である.従来の方法では微細な脂質局在を解明することが原理的に困難であると考えられるため,我々は急速凍結した細胞膜を白金・カーボン薄膜で物理的に固定する凍結割断レプリカを用いてPIsの超微局在を可視化し,定量的に解析する方法を創出した.既に昨年度までの研究で特異性,標識効率性などが十分に確保された PI(4,5)P2に対するプローブ(GST-PH)を用いて,急速凍結して得た培養細胞のレプリカを標識,解析した.その結果,平坦な細胞膜のPI(4,5)P2は弱いクラスターを形成して存在すること,上記のクラスターはコレステロール抽出でやや低下するが,アクチン脱重合でほぼ完璧に消滅すること,PI(4,5)P2は特にカベオラ周囲に顕著に集中すること,細胞内カルシウム上昇によって標識は激減するが,生理的リガンドによる刺激ではカベオラ周囲のPI(4,5)P2が保たれる場合が多いことなどが明らかとなった.これらの結果は生細胞でのPI(4,5)P2の分布をナノスケールで初めて明らかにしたものであり,カベオラが平坦な細胞膜部分とは異なる特殊な領域を形成することを示した点で重要である.

PHYSIOLOGICAL FUNCTION OF LIPID DROPLETS AND REGULATION OF INTRACELLULAR LIPID TRAFFICKING

Grant-in-Aid for Scientific Research (B)

Project Year :

2005

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2006

 

FUJIMOTO Toyoshi, FUJITA Akikazu, OHSAKI Yuki

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The dynamic properties of lipid droplets have become more apparent by our recent studies. During the period supported by the current grant, we obtained the following results. 1. Rabl8 was found to localize to lipid droplets specifically. When Rab18 was overexpressed, ADRP decreased, and close association of lipid droplets and the endoplasmic reticulum became prominent. The same structure also increased upon knockdown of ADRP or by brefeldin A treatment. These results suggested that Rab18 induces the lipid droplet-associated membrane structure (LAM) through dislocation of ADRP. 2. In hepatocyte-derived cell lines (Huh7, HepG2), ApoB was found to form a crescent-shaped structure around lipid droplets (ApoB-crescent). The ApoB-crescent increased drastically when proteasome or autophagy was prohibited. Proteasomal subunits were concentrated around lipid droplets, and ApoB recovered in the lipid droplet fraction was highly ubiquitinated. The result suggested that lipid droplets are a platform for ApoB to be processed by proteasome and autophagy. 3. TIP47, a member of PAT family proteins, was recruited to lipid droplets when cells were added with fatty acids. The localization of TIP47 to lipid droplets required its N-terminal portion. On the other hand, disruption of the C-terminal portion, which was speculated to form a hydrophobic cleft, induced constitutive localization to lipid droplets. These results further revealed that lipid droplets have a variety of functions in relation to intracellular lipid homeostasis.

定量的可視化法による癌細胞でのラフト破綻の解析

特定領域研究

Project Year :

2005

　

　

 

藤本 豊士, 藤田 秋一, 大崎 雄樹

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細胞膜にはスフィンゴ脂質,コレステロールなどで形成される脂質ラフトが存在すると仮定され,ラフトにはH-Ras, Srcなどシグナル伝達に係わる分子が集中すると考えられている.ラフトの破綻は細胞増殖制御の異常に直結すると予想される.しかしラフトは温度変化,プローブ結合などで容易に変動すると予想され,生きた細胞でのラフトの実体については多くの議論がある.我々は生きた細胞でのラフトの有無や諸性質を知り,シグナル伝達過程の異常との関係を検索するために急速凍結・凍結割断レプリカ標識法を用いた検索方法の開発と応用を目的として研究を進めている. 今年度はラフトを構成する分子であるGM1,GM3について実験を行い,分布をRipleyのK関数などで解析して以下の結果を得た.1)マウス線維芽細胞では半径約50nmのクラスターを形成する領域が大半を占め,一個の細胞は全域で同一の分布パターンを示した.2)クラスターはGM1の分布密度にかかわらず存在した.3)コレステロールを減少させた細胞あるいは4℃で処理した細胞では,クラスター分布の領域は減少し,大半の細胞でランダムな分布を示す領域との混在が見られた.4)GM3もクラスター分布を示すが,GM1,GM3は共通のクラスターを形成する場合と,別々のクラスターを形成する場合があった.これらの結果は,GM1がクラスターを形成し,コレステロール依存性に変化する点でラフト説を支持する.一方,コレステロール減少や低温による変化がクラスターの解消ではなく,ランダム分布との混在をもたらすことを初めて明らかにした.