共同研究・競争的資金等の研究課題 - 大﨑　雄樹

脂肪滴の細胞質および核内での生理機能解明

基盤研究(B)

研究期間:

2024年04月

-

2027年03月

 

大崎 雄樹, 和田 亘弘

核内脂肪滴の肝疾患における意義

研究期間:

2023年04月

-

2025年03月

 

大﨑雄樹

担当区分： 研究代表者

脂肪滴の核内での形成機構と生理機能の形態学的解析

研究期間:

2023年04月

-

2025年03月

 

大﨑雄樹

担当区分： 研究代表者

核膜変形機構と核内脂質代謝の細胞老化への影響の解明

研究期間:

2023年04月

-

2024年03月

 

大﨑雄樹

担当区分： 研究代表者

脂肪滴による核内蛋白質機能制御機構の解明

研究期間:

2022年08月

-

2027年05月

 

大﨑雄樹

担当区分： 研究代表者

核内脂肪滴機能の解明

日本学術振興会 科学研究費助成事業 基盤研究(A)

研究期間:

2022年04月

-

2025年03月

 

藤本豊士, 大﨑雄樹, 辻琢磨

担当区分： 研究分担者

核内脂肪滴の新規生理機能

基盤研究(C)

研究期間:

2021年04月

-

2024年03月

 

大崎 雄樹

　研究概要を見る

コレステロールエステル（CE）とトリアシルグリセロール (TAG)から成る中性脂質をリン脂質一重膜が覆う構造である脂肪滴は、通常小胞体膜から形成される細胞質オルガネラであるが、我々は肝由来細胞では脂肪滴が核膜陥入構造と近接し、タンパク質修飾や遺伝子発現制御に関与するPML小体と複合体を形成して存在すること、核内脂肪滴は小胞体内腔の中性脂質顆粒であるリポプロテイン前駆体に由来し、ホスファチジルコリン（PC）合成を活性化させて小胞体ストレスを軽減する装置として働き得ることを以前に報告した。一方核内脂肪滴は非肝由来細胞でも形成されることから、細胞の種類を問わないユニバーサルな形成機序の存在が示唆されていた。 本計画において今年度はまず非肝由来細胞における新規の核内脂肪滴形成機序を探索した結果、内核膜には本来小胞体に局在する脂質合成酵素群が存在し、核内で直接、中性脂質合成と脂肪滴形成が行われることを明らかにした。さらに細胞質脂肪滴の形成に重要な小胞体膜貫通タンパク質Seipinが、ジアシルグリセロール (DAG)合成酵素であるLipin1 betaの転写を抑制することで核内脂肪滴の形成を負に制御することを見出した。これらの成果は国際学術誌および国内学会において報告した。 一方、核膜の変形を司る分子候補Tの発現量と核内脂肪滴および核膜陥入構造（NR）の形成とが逆相関することを見出した。さらに肝疾患疑い患者の肝生検試料の電顕観察により、人の肝細胞内で実際に核内脂肪滴が頻繁に形成されることが判明した。 他方核内脂肪滴の生理的意義の解明については、一部の脂肪酸結合タンパク質が核内脂肪滴に局在し、がん形成促進因子の転写を制御することを見出した。また一部のDNA損傷修復系分子が核内脂肪滴に局在することを見出した。

脂肪滴表層の機能に関する研究

基盤研究(A)

研究期間:

2018年04月

-

2021年03月

 

藤本 豊士, 大崎 雄樹, 辻 琢磨

　研究概要を見る

１）核内脂肪滴について：前年度までの研究により、肝細胞では、リポタンパク質前駆体がつくる小胞体内腔の脂肪滴が内核膜の破綻部を通り抜けて核内脂肪滴となること、またそのようにして形成された核内脂肪滴にホスファチジルコリン合成の律速酵素であるCTP:phosphocholine cytidylyltransferase (CCT)が結合して活性化されることを明らかにした。今年度はリポタンパク質形成能を持たない細胞について検討し、内核膜に分布するトリグリセリド合成酵素によって核内脂肪滴が形成されること、また内核膜での核内脂肪滴形成には細胞質脂肪滴の形成に重要な機能を担うセイピンが関与しないことを見出した。非肝細胞での核内脂肪滴はホスファチジルコリン合成に与える影響は小さく、肝細胞の核内脂肪滴とは形成機序だけでなく、機能的意義も異なることが示唆された。 ２）オートファジーで形成される脂肪滴について：飢餓によってオートファジーが誘導された細胞で新たに形成される細胞にはCCTが集中し、ホスファチジルコリン合成を活性化することを見出した。隔離膜・オートファゴソームはこのような脂肪滴の直近で形成され、またCCTをノックダウンするとオートファジー活性を長時間にわたって維持することができなくなった。これらの結果は飢餓時に形成される脂肪滴がCCTをリクルートしてホスファチジルコリン合成を活性化することによって隔離膜・オートファゴソームの形成を促し、オートファジーの継続に重要な役割を担うことを示唆した。

核内脂肪滴と核膜陥入構造の機能的連関

基盤研究(C)

研究期間:

2018年04月

-

2021年03月

 

大崎 雄樹

　研究概要を見る

脂肪滴は中性脂質をリン脂質一重膜が覆う構造であり、小胞体膜から形成される細胞質オルガネラと考えられて来たが、我々は肝由来細胞の核内では脂肪滴が核膜陥入構造と近接し、タンパク質修飾や遺伝子発現制御に関与するPML小体と複合体を形成して存在することを以前に報告した。本研究では核内脂肪滴の形成機序と機能をより詳細に解明することを目的とする。2018年度までの研究成果として、肝癌由来細胞において核内脂肪滴は小胞体内腔で形成されたリポプロテイン前駆体に由来すること、ホスファチジルコリン (PC) 新規合成経路の律速酵素CCT alphaが核内脂肪滴に集積し活性化されることにより、小胞体ストレスが軽減されることなどを見出し、報告した。 2019年度は、核膜陥入構造と核内脂肪滴の形成に関与し得る分子をさらに検索した結果、すでに小胞体および核膜の形態変化に関与すると知られていた候補分子Tを同定した。また、すでに細胞質での脂肪滴融合に関与すると知られていたCidebが、形成後の核内脂肪滴の融合にも関与し得ることを同定した。同分子の発現抑制により核内脂肪滴の融合が遅延し、数が増加すること、さらにCCTalpha陽性の核内脂肪滴を保持する細胞の増加およびPC合成亢進が起こることを見出した。一方、核内脂肪滴-PML複合体上には活性化型に修飾を受けた転写因子の一部が集積することを見出した。これらの結果は海外学術誌への論文発表に向けて準備中である。他方、脂肪滴がコレステロールエステル (CE) 優位になると、CEが液晶化し、脂肪滴表層の構造にも影響し得ることを試験管内、細胞内実験、生物物理学的解析から見出し、脂肪滴のコア脂質組成が、核内を含めた脂肪滴表層分子を制御し得る重要な因子であることを報告した。

膜脂質分布・動態に関する細胞生物学的研究

基盤研究(A)

研究期間:

2015年04月

-

2018年03月

 

藤本 豊士, 大崎 雄樹, 辻 琢磨, 山本 林, 田口 友彦, 高鳥 翔

　研究概要を見る

ホスファチジルイノシトール3,5-二燐酸、ホスファチジルイノシトール3,4-二燐酸、ホスファチジルセリンについて、急速凍結・凍結割断レプリカ標識法で特異的かつ高効率に標識する方法を確立し、それぞれの脂質の詳細な細胞内分布の観察に成功した。肝細胞などの核内に見られる脂肪滴の形成にPML-IIの発現が必要であることを示し、核内脂肪滴がPML小体や核内に見られる核膜の延長構造と近接して分布することを明らかにした。静止期や窒素飢餓時の出芽酵母で見られる脂肪滴のミクロオートファジーがラフト様膜ドメインで起こり、ニーマンピック病Ｃ型タンパク質がドメイン形成に必要なステロール輸送に関与することを示した。

核内における脂肪滴の生理的意義

基盤研究(C)

研究期間:

2015年04月

-

2018年03月

 

大崎 雄樹, ヨキタロ エイヤ

　研究概要を見る

中性脂質のコアをリン脂質一重膜が覆うオルガネラである脂肪滴は通常細胞質で形成されるが、肝由来細胞などでは核内にも多く形成される。本計画では核内脂肪滴の形成機序と機能の解明を目指した。 形態学的解析の結果、核内脂肪滴は小胞体内腔で形成されるリポプロテイン前駆体が核膜陥入構造を経由して核質に遊離したものであることが示唆された。 一方核内脂肪滴はホスファチジルコリン（PC）新規合成経路の律速酵素CCTalphaが集積して活性化する場である可能性が示唆された。CCTalphaの核内脂肪滴局在を増加させることによりPC合成と小胞体ストレスに対する細胞保護効果を増強できることが示唆された。

脂質超分子構造の形成メカニズム

基盤研究(B)

研究期間:

2012年04月

-

2015年03月

 

藤本 豊士, 大﨑 雄樹, 鈴木 倫毅

　研究概要を見る

脂質が構造の基盤を形成するドメイン（脂質超分子構造）である脂肪滴、オートファゴソーム、脂質ドメインについて研究を行った。その結果として、1) 肝細胞において脂肪滴局在分子UBXD8を欠損するマウスではリポ蛋白質の分泌に異常が生じ、特異な脂肪肝が起こること、2) オートファゴソームに必須の膜脂質であるホスファチジルイノシトール３燐酸が、出芽酵母と哺乳類細胞では全く異なる分布を示すこと、3) 代表的な燐脂質であるホスファチジルコリンの細胞膜両葉への分布（非対称性）が出芽酵母と哺乳類細胞では異なること、などを明らかにした。

脂肪滴と細胞内蛋白質分解メカニズムの機能的相関

若手研究(B)

研究期間:

2009年04月

-

2010年03月

 

大崎 雄樹

　研究概要を見る

肝癌由来細胞株Huh7では脂肪滴(LD)-小胞体(ER)融合構造(ApoB-crescent)がプロテアソーム,オートファジー阻害剤処理等により増加する.21年度は以下の様に研究を進めた(到達目標項目別に列挙). 1. 脂肪滴-小胞体融合構造がApoBの特殊な分解装置として機能する事の立証. Hun7から精製した脂肪滴画分のプロテオーム解析によりユビキチン化関連分子群が多数同定された. (1) Huh7細胞(一部はクローニングした各分子を一過性発現)からショ糖密度勾配遠心により回収した脂肪滴画分中に各分子が局在する事を特異的抗体/エピトーグタグ抗体を用いて再確認した. (2) 候補分子のうち2種(A,B)の発現をRNAiにより抑制すると,細胞内ApoB量及びApoB分泌量が減少した. (3) 別の2分子(C,D)の発現抑制により,脂肪滴蛋白質であるADRP量,及び脂肪滴数が増加した. ApoB,ADRPのユビキチン化,蛋白質寿命等を解析し,それぞれの分解に寄与する分子複合体の同定を目指す. 2. 脂肪滴周囲におけるApoB-VLDL代謝とヒトC型肝炎ウイルスHCV複製機構の関連の解明. HCV粒子産生・分泌過程はApoB-VLDLの生合成/分泌過程と相関する. (4) Huh7.5細胞:HCV-JFH1株を用いたHCV産生培養系を利用して,小胞輸送障害剤あるいはADP-リボシル化阻害剤処理(ApoB-crescent及びApoB分泌を抑制する;未発表)により感染性HCV粒子形成量が減少する事を確認した.今後は項目1の候補分子群を抑制した細胞培養系において感染性HCV粒子形成率を評価する.

脂質超分子構造の細胞生物学的解析

基盤研究(B)

研究期間:

2009年

-

2011年

 

藤本 豊士, 大崎 雄樹, 鈴木 倫毅, 藤田 秋一

　研究概要を見る

(1)脂質付加されたApoBがプロテアソーム分解を受ける際に小胞体内腔から脂肪滴表面に移行し、その過程にUBXD8, Derlin-1が関わることを見出した。Derlin-1は小胞体内腔から脂肪滴表面へ、UBXD8は脂肪滴表面からプロテアソームへのApoB移送に関与する。この結果は脂肪滴を足場とするApoB分解の分子メカニズムを初めて明らかにしたものである。 (2)急速凍結・凍結割断レプリカ標識法により、PI(4, 5) P2のナノ局在を明らかにした。PI(4, 5) P2が培養線維芽細胞のカベオラやコーテッドピットの開口部に集積し、リガンド刺激時に膜平坦部と異なる挙動を示すこと、またラット体内の膵外分泌細胞ではギャップ結合に多く分布することなどが明らかになった。

脂肪滴に局在する蛋白質分解機構の解析

特定領域研究

研究期間:

2009年

-

2010年

 

藤本 豊士, 藤田 秋一, 鈴木 倫毅, 大崎 雄樹

　研究概要を見る

肝細胞における超低比重リポ蛋白質(VLDL)形成の初期段階では、アポリポプロテインB100(ApoB)の翻訳に同期して脂質成分が付加され、脂肪滴がこの際の脂質を供給することが知られている。我々はこれまでの研究により、脂肪滴が、脂質付加されたApoBがプロテアソームやオートファジーで分解される足場ともなることを見だした。またこれらの蛋白質分解系を阻害すると、脂肪滴の周囲にユビキチン化したApoBが蓄積する特異な構造(ApoB-crescent)が出現することも明らかにした。プロテアソームで分解されるためには脂質付加後のApoBが小胞体内腔から細胞質側に輸送される必要がある。今回の研究ではその分子機構を明らかにするため、ApoB-crescentを大量に含む脂肪滴を精製し、質量分析法によるプロテオーム解析で複数の蛋白質分解関連分子を同定した。その内の1つ(X)の機能を阻害すると、脂質付加後のApoBは細胞質側に出ることができなくなり、Xが小胞体内腔から細胞質への逆行輸送に必須の成分であることが示唆された。また、他の蛋白質(Y)の発現を阻害すると、ユビキチン化されたApoBが脂肪滴の細胞質側表面に蓄積し、YがApoBのプロテアソームへの供与に必要であることが明らかになった。X,Yともに機能阻害によって小胞体内腔に脂質付加ApoBが蓄積し、特にYの阻害ではApoB分泌が有意に減少した。これらの結果は脂肪滴が脂質付加後ApoBの逆行輸送と分解の場であり、X,Yがその機構に重要な役割を果たす因子であることを示すものである。

がん細胞の増殖,浸潤機構と脂質ドメイン

特定領域研究

研究期間:

2008年

-

2009年

 

藤本 豊士, 藤田 秋一, 大崎 雄樹, 鈴木 倫毅

　研究概要を見る

膜脂質の正確な局在をナノメートルレベルで決定することは膜生物学だけでなく,細胞増殖,細胞運動など種々の現象を分子レベルで理解するために重要である。しかし,通常の化学固定剤は脂質に作用せず,また様々な刺激が局在変化を惹起する可能性があるため,膜脂質に関する理解は進んで来なかった。我々は今回の研究により急速凍結と凍結割断レプリカ標識法を組み合わせることにより,膜脂質を物理的に固定し,局在を決定する方法を開発した。その方法を用いて,細胞骨格,小胞輸送などの制御に重要な役割を果たすフォスファチジルイノシトール4,5二燐酸(PIP2)の挙動を明らかにした。PIP2は線維芽細胞の平坦な膜領域ではごく弱いクラスターを形成するのみであったが,カベオラ開口部,コーテッドピット辺縁部には高度な集中を示した。Angiotensin II刺激後,平坦な膜領域では10秒でPIP2標識密度は最低レベルに低下し,2分までに徐々に回復した。カベオラのPIP2は10秒では変化せず,40秒で最も低下し,2分で静止期レベルに回復した。コーテッドピットは10秒でやや減少したが,その程度は平坦な膜領域に比較してごく軽度であった。PIP2の集合は,カベオラではカベオリンに,コーテッドピットではepsin, dynaminなどのエンドサイトーシス関連蛋白質に結合することによって生じると考えられる。今回の結果は,3つの異なる挙動を示すPIP2のプールが形質膜に存在することを明確に示した。本研究で開発した方法は高い空間解像度を持ち,任意の細胞に応用することができる。動物体内の細胞など,多くの実験系への応用が考えられ、癌細胞の挙動解析にも重要なツールとなる。

脂質滴ーER複合体の蛋白質分解系への関与の立証

若手研究(B)

研究期間:

2007年04月

-

2009年03月

 

大崎 雄樹

担当区分： 研究代表者

　研究概要を見る

肝癌由来培養細胞株ではApolipoprotein B(ApoB)が脂質滴周囲に蓄積する(ApoB-crescent). プロテアソーム阻害下で同構造の形成は増加し, 同構造内のApoBはユビキチン化されており, 脂質滴とApoB分解機構との関連が疑われた. 形態学的解析からApoB-crescentとはApoB, ERシャペロンを含む特殊なER由来膜が脂質滴に密着した複合体であると判明してきた. 本研究では(1)超微細構造解析, 局在分子決定等により脂質滴－ER複合体の構造的連関を更に明らかにし, (2)脂質滴蛋白質, ERシャペロン, ER形態制御因子等の発現操作を通じて同複合体とApoBのプロテアソーム分解系との機能的連関を明らかにする.

脂質滴ーER複合体の蛋白質分解系への関与の立証

若手研究(B)

研究期間:

2007年

-

2008年

 

大崎 雄樹

　研究概要を見る

肝細胞では脂質滴(Lipid droplet : LD)由来の脂質とApolipoprotein B (ApoB)とが小胞体で結合して超低比重リポプロテイン(VLDL)が合成される. 本研究は (1)脂肪滴と小胞体の一部(ApoBが貯留する)が融合した構造(ApoB-crescent)がプロテアソーム阻害剤処理時に増加する事, (2)脂質滴画分には多くのプロテアソーム分解系関連因子が存在する事を肝癌由来培養細胞を用いて明らかにし, 脂質滴周辺でのApoB代謝機構の存在を示唆した.

細胞内脂質滴の細胞生物学的解析

基盤研究(B)

研究期間:

2007年

-

2008年

 

藤本 豊士, 藤田 秋一, 大崎 雄樹, 鈴木 倫毅

　研究概要を見る

肝細胞の脂肪滴について次のような成果を得た. (1) プロテアソーム阻害, 多価不飽和脂肪酸投与などにより, 小胞体内腔と細胞質の両方に面する特殊な脂肪滴が出現することを見出し, 脂質エステルが小胞体膜中に蓄積し得ることを明確に示した. (2) 脂質付加後のApolipoprotein Bは小胞体の内腔にあるため, 同分子が細胞質側でプロテアソーム分解を受けるためには特殊な機構が必要であることが示唆された.

定量的可視化法による癌細胞でのラフト破綻の解析

特定領域研究

研究期間:

2006年

-

2007年

 

藤本 豊士, 藤田 秋一, 大崎 雄樹

　研究概要を見る

細胞膜ラフトには癌遺伝子産物を含む様々なシグナル伝達関連分子が集積するため、ラフト構造の破綻は細胞分化・増殖の異常の原因となると推測されている.しかしラフトを解析する手段はきわめて限られており,生細胞でのラフトの実体は長く論争の渦中にある.本研究では,微弱な分子間相互作用で形成されている可能性の高いラフトを解析するため,細胞膜分子の動態に人工的な変化をもたらしうる処理やプローブを使わずに解析する方法の開発を進めてきた.本年度の成果は以下の通りである. 1)生化学的にラフトへの集中が推測されていたPI(4,5)P2は平坦な細胞膜では弱いクラスターを形成して存在すること,上記のクラスターはコレステロール抽出でやや低下するが,アクチン脱重合でほぼ完璧に消滅すること,PI(4,5)P2がカベオラ開口部に顕著に集中することなどが判明した.これらの結果は生細胞でのPI(4,5)P2の分布をナノスケールで初めて明らかにしたものであり,カベオラが平坦な細胞膜部分とは異なる特殊な領域を形成することを示した点で重要である. 2)PI(4,5)P2はv-Src発現細胞に形成されるinvadopodium周辺では少なかった.一方,invadopodiumに集積するPI(3,4)P2は細胞膜平面には少なく,おもに細胞骨格成分で構成される領域に分布することが明らかになった.このような結果は従来の方法では得られておらず,癌細胞の浸潤機構に示唆を与えるものである.