共同研究・競争的資金等の研究課題 - 本望　修

脊髄損傷に対する骨髄間葉系幹細胞移植による、脳脊髄での可塑性亢進メカニズムの解析

基盤研究(C)

研究期間:

2021年04月

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2024年03月

 

岡 真一, 佐々木 祐典, 横山 貴裕, 本望 修, 鵜飼 亮

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令和3年度、当院にMSC治療を目的に入院した脊髄損傷症例は、おおよそ20例を数え、順調に症例数を積み重ねている状況である。全ての脊髄損傷症例の脳、脊髄のMRIデータを検証した。撮像時期は、原則、入院時、投与直前、 投与1ヶ月後、投与3ヶ月後、投与6ヶ月後の時点としていたかが、投与条件に当てはまらず投与を受けなかった症例や入院病床の調整の関係で、MRIの撮像を出来ない症例も散見された。特に脳DTIデータを用いたコネクトーム解析では、標準化の方法、使用する脳atlasの選択、ROI間の接続強度の閾値設定など、症例間でばらつきのない均一な解析を実施するためのパラメータの設定の検討を引き続き実施している。さらに、T1WI、T2WIなどを用いて大脳皮質厚や体積などの構造学的なデータ解析も同時に実施し、コネクトーム解析で得られた結果との比較も実施している。また、脊髄MRIでは、個々の症例においてDTI解析の可否や、定量的な解析を実施し、データの蓄積を行っている。撮像データの解析、特にDTIデータの解析を目的として高機能のパーソナルコンピューターを別途購入し、専用のアプリケーションにて解析を実施した。 ラット脊髄損傷モデルに対して骨髄間葉系幹細胞(MSC)の経静脈投与することによって、中枢神経系にどのような神経回路の再構築(plasticity)が生じるかを検証するため、ラット胸髄Th9レベルの脊髄損傷モデルを作成し、動物用MRIでの撮像条件の最適化を検討した。8-9週齢のSDラットを購入し、ラット用脊髄損傷作 成装置(IH-0400 Impactor; PSI社製)を用いて、安定した損傷部位を作成できることを確認した。その後、動物実験用高磁場MRI装置にて、脳、脊髄おける各種プロトコール(T1、T2、DTI等)での撮像を行い、撮像条件の調整を行い最適な撮像条件の検討を行った。

脳梗塞に対する骨髄幹細胞治療における分子メカニズムに基づく至適リハビリ条件の探索

基盤研究(C)

研究期間:

2020年04月

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2023年03月

 

佐々木 雄一, 佐々木 祐典, 岡 真一, 佐々木 優子, 本望 修, 山下 達郎, 鵜飼 亮

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近年、骨髄間葉系幹細胞(MSC)を用いた細胞療法(MSC治療)は、再生医療の分野で脳梗塞や脊髄損傷に対する新しい治療方法として注目されている。我々は、既にラット脳梗塞モデルに対するMSC移植にリハビリを併用すると、リハビリ単独群やMSC移植単独群よりも、さらに高い運動機能の回復が得られるこという報告をし た。MSCは、1)梗塞巣周囲に集積し、2)脳梗塞体積を減少させ、3)脳梗塞周辺領域のシナプス新生を誘導し、4)脳梁萎縮を抑制、するが、リハビリを併用すると、脳の可塑性のさらなる亢進を誘導することが可能となり、より高い治療効果が得られることを明らかにした。しかし、実臨床に目を向けると、MSC治療とリハビリの至適なプロトコルの確立はなされておらず、様々な議論が絶えない状況である。一方、最近のリハビリの動向として、早期リハビリや高負荷・高頻度のリハビリの有用性、さらに、日常生活における適切な環境因子に注目が集まっている。本研究は、MSC移植に併用する適切な運動(リハビリ)の種類や頻度・強度 とともに、飼育環境も考慮し、回復経過を分子メカニズムなど様々な視点から詳細に比較解析することで、MSC移植の治療効果を最大限に引き出すための新しいリハビリ方法を確立することを目的としている。特に、運動強度と運動時間をなどの負荷量に注目し、脳の可塑性のパターンの変化、神経回路の再構築、シナプス新生などの観点から解析を進めている。現在までに、本研究費によって、各運動負荷における実験的脳梗塞に対する治療効果の行動学的解析、MRI解析、神経トレーサーを用いた神経解剖学的解析などを行っている。以上のように、補助金は補助条件に従って、有効に使用されている。

早産児脳障害に対する骨髄間葉系幹細胞を用いた新規治療法の開発

基盤研究(C)

研究期間:

2020年04月

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2023年03月

 

寺田 光次郎, 川崎 幸彦, 佐々木 祐典, 福村 忍, 小林 正樹, 坂井 拓朗, 本望 修, 飯塚 裕典

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我々は、予備実験において、胎生18日目の妊娠SDラット（妊娠期間：21日）に対して、エンドトキシンであるリポポリサッカライド（LPS）を腹腔内投与し、出生した日齢7の新生仔ラットに左総頚動脈結紮・低酸素暴露をすることで、脳室周囲の白質に虚血領域を呈する脳室周囲白質軟化症（Periventricular leukomalacia：PVL）モデルラットを作成した。PVLモデルラットは、低酸素虚血単独群（左総頚動脈結紮・低酸素暴露のみ、母体LPSなし）と比較して、大脳の虚血容積が増大し、重症になることが判明した。 本研究では、PVLモデルラットに対して、別の成体ラットより採取、培養した骨髄間葉系幹細胞（Mesenchymal stem cell：MSC）を経静脈的に投与し、急性期MSCの治療効果と作用メカニズム、特に発達脳における神経保護効果や神経可塑性の亢進について検証している。 日齢10のPVLモデルラットを、MSC群とVehicle群に振り分け、MSCまたはDMEM（培養液のみ、細胞なし）を経静脈的に投与した。運動機能の評価としてロータロッド試験、シリンダー試験、空間認知機能の評価としてモリス水迷路試験を用いて行動学的解析を実施した。これまでに、MSC群で良好な結果が得られており、MSC治療の有効性を確認した。また動物用7T-MRIを用いて、MSC投与前後における大脳の虚血体積および残存大脳容積、脳血流の変化について検証した。観察期間終了後の脳組織を用いて、拡散テンソル画像による神経線維の評価、免疫化学染色による神経細胞や脳の髄鞘化の動向について検証している。

脊損に対する骨髄幹細胞治療後の網羅的遺伝子解析による“脳および脊髄の反応”の解明

基盤研究(C)

研究期間:

2020年04月

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2023年03月

 

押切 勉, 廣田 亮介, 山下 敏彦, 岡 真一, 佐々木 優子, 本望 修, 栗原 康太, 福士 龍之介

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我々は脊髄損傷患者に対する自己骨髄幹細胞(MSC)の静脈的投与を行った医師主導治験において、脳のMRI diffusion tensor imaging (DTI)を用いたコネクトーム解析を行い、脳のplasticityが亢進していることを見出した。さらに、最近では、脊髄損傷ラットモデルにMSC移植を行い、運動機能の回復が現れた移植3日目に大脳皮質運動野の網羅的遺伝子解析を行った結果、複数の遺伝子の発現量に変化があり、これらの遺伝子の多くは神経再生、plasticityの亢進に関与する遺伝子であることを報告した(Oshigiri et al.,2019)。そこで本申請では、先行研究を発展させ、大脳皮質の更なる解析に加えて脊髄損傷局所の網羅的遺伝子解析を複数の観察ポイントで行い、運動機能の改善に関与する遺伝子のプロファイルを解析し、中枢神経系全体の遺伝子発現の変化を総合的に考察することで、次世代の治療法に展開させることを目的とする。 現在までに、本研究費によって、ラット脊髄圧座モデルを作成し、MSCを左大腿静脈より投与し、下肢運動機能の行動解析をBBBscore行い、投与群の優位性を認めた。移植後3日目および7日目の大脳皮質運動野のMicroarrayによる網羅的遺伝子解析を行っている。これまでのところ、移植後7日目と比較して、3日目の大脳皮質の遺伝子が大きく変化しており、運動機能回復に関連した遺伝子がいくつか判明され、その経時的な変化の解析を行っているところである。また、脊髄及び脳の組織から得られた複数タイムポイントの遺伝子情報を元に、複数のデータベース（Gene Ontology解析、パスウェイ解析、エンリッチ解析、タンパク質相互作用解析、プロモーター解析）を用いて、統合的に遺伝子発現解析を行う。 以上のように、補助金は補助条件に従って、有効に使用されている。

神経膠腫の浸潤機序解析と浸潤能を標的とした先駆的治療法の開発

基盤研究(C)

研究期間:

2020年04月

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2023年03月

 

鰐渕 昌彦, 川端 信司, 佐々木 祐典, 平松 亮, 池田 直廉, 古瀬 元雅, 野々口 直助, 佐々木 優子, 本望 修

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アクチンのisoformは６種類が知られている。それらのうち、肥大型心筋症との関連や心室中隔欠損症の責任遣伝子として注目されているのがACTC1（actin, alpha cardiac muscle 1）である。我々はACTC1が悪性脳腫瘍、特にグリオーマの予後や浸潤能に関与することを見出した。本研究ではACTC1の更なる役割を解明し、遺伝子ネットワークの解析や治療薬の開発に繋げることを目的としている。TCGA PanCancer Cell line Atlasに登録されている1,156種類のがん細胞株における遺伝子発現データを解析した結果、ACTC1は「上皮間葉転換」の主要なマーカー遣伝子であるFN1、SNAI1、ZEB1、TWIST1、VIM、FOXC2の発現量と相関があることを確認したので、ACTC1の発現と上皮間葉転換との関連について研究を行っている最中である。また、ACTC1のプロモータ配列に対し親和性の高い転写因子として、転写因子のデータベースより、SMARCA4、RB1、POLR2A、CBFA2T2、WT1、GLIS1が相関することを確認した。さらにヒトグリオーマ細胞株８株を用いてtranscriptome解析 を行った後、ACTC1の発現量と共変動を示す遺伝子を対象としてpathway解析を実施した.結果、Rap1、Hippo、Relaxin、Apelin、Sphingolipid、C-type lectin receptor及びOxytocinのsignaling pathwayがACTC1の発現に有意な関連を持つsignaling pathwayとして同定された。 同様の手法を用いて、高悪性度髄膜腫や転移性脳腫瘍など、他の悪性脳腫瘍の細胞についてもACTC1の発現や役割の解析を行っている。

脊髄損傷に対する骨髄幹細胞治療でダイナミックに再構築された神経回路の機能解析

基盤研究(B)

研究期間:

2020年04月

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2023年03月

 

佐々木 祐典, 廣田 亮介, 栗原 康太, 小原 尚, 横山 貴裕, 押切 勉, 岡 真一, 佐々木 優子, 寺島 嘉紀, 本望 修

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我々は脊髄損傷動物モデルに対する骨髄間葉系幹細胞(mesenchymal stem cells: MSC)の経静脈的投与による機能回復のメカニズムとして、“損傷局所”における神経保護作用、血液脊髄関門の安定化、損傷軸索のsproutingや、損傷軸索の再生、再有髄化、シナプス新生等が多段階的に作用することにより、運動機能の回復に貢献することを明らかにしてきた。これらのメカニズムに加えて、損傷周囲および脳における神経回路のダイナミックな再構築によって、“中枢神経系全域の再生・plasticityの賦活化”が惹起される、という治療メカニズムも強く寄与している可能性があるのではないか、という仮説を検証することを目的としている。 本研究では、実験的脊髄損傷に対するMSC治療後に惹起される損傷周囲および脳における神経回路の再構築を、順行性神経軸索トレーサーによる神経解剖学的トレーシング法、Ex vivo MRI Diffusion Tensor Tractography (DTT)などを駆使して、解明する予定である。特に、神経解剖学的解析においては、共焦点レーザー顕微鏡(Zeiss)、光シート顕微鏡（ミルテニーバイオテク）により画像を取得し、高精細3D/4D画像解析ソフトを用いた神経ファイバーのトレーシング、ヒートマップ解析等を行っている。これら一連の実験により、実験的脊髄損傷に対するMSC治療によってダイナミックに再構築された神経回路の解析を行うことが可能になると考えている。以上のように、補助金は適切に使用されている。

骨髄間葉系幹細胞移植を用いた難治性てんかんに対する新規治療法の開発

基盤研究(C)

研究期間:

2019年04月

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2022年03月

 

福村 忍, 佐々木 祐典, 本望 修, 寺田 光次郎

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本研究では、既にてんかんをきたした慢性期けいれん重積動物モデルに対して、骨髄間葉系幹細胞（Mesenchymal stem cell: MSC）治療を行うことで、てんかんの抑制効果を有するかを検討した。リチウム-ピロカルピンによるけいれん重積後にてんかんを発症したラットに対して、けいれん重積後60日目に、MSCもしくはvehicle（DMEMのみ、細胞なし）を経静脈的に投与した。MSC投与群はvehicle投与群に比べ、てんかん発作減少効果およびガンマ帯域の減少効果を認めた。MSCは、けいれん重積後の慢性期のてんかんに対し、けいれん数および脳波上の興奮性を軽減させるに有効であると考えられた。

骨髄幹細胞の自己治癒能と全身の恒常性維持による健康寿命延長

基盤研究(C)

研究期間:

2019年04月

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2022年03月

 

佐々木 優子, 佐々木 祐典, 小野寺 理恵, 岡 真一, 本望 修, 鵜飼 亮, 横山 貴裕

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超高齢化社会を迎える日本にとって、老化メカニズムを解明し、健康寿命を延長することは最重要課題である。骨髄間葉系幹細胞は、損傷時における治癒プロセスに貢献しており、既に複数の疾患をターゲットとした臨床応用が試みられている。我々は、これまでの研究から、老化により生体内の間葉系幹細胞が機能低下を起こすことが、個体の老化の原因となっているとの仮説を立て、神経疾患動物に対して、ラットから採取したＭＳＣを経静脈的に投与した結果、寿命の延伸効果が得られることを報告した。本研究の成果により、健康寿命の延長が可能となれば、超高齢化社会を迎えているわが国において、大きな福音となり、波及効果は極めて高いと思われる。

脳梗塞に対する骨髄幹細胞移植による神経回路の再構築における分子メカニズムの解明

基盤研究(C)

研究期間:

2019年04月

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2022年03月

 

本望 修, 佐々木 祐典, 小野寺 理恵, 岡 真一, 佐々木 優子

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我々は急性期脳梗塞モデルを用いて骨髄幹細胞(mesenchymal stem cell: MSC)の経静脈的投与が治療効果を発揮し、そのメカニズムに両側の大脳皮質運動野を結ぶ神経線維が増加し、神経可塑性の亢進があることを報告した。本研究では、神経可塑性の亢進は、局所にとどまらず全脳においても誘導されていることを見出した。MSCによって惹起された全脳における神経可塑性の亢進が治療効果の向上に貢献することが判明したことで、今後の更なる治療方法の開発につながると思われる。

実験的脊髄損傷後に生じる脳における可塑性の骨髄間葉系幹細胞による亢進作用の解析

基盤研究(C)

研究期間:

2018年04月

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2021年03月

 

長濱 宏史, 鈴木 淳平, 佐々木 祐典, 中崎 公仁, 本望 修

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脊髄損傷モデルに対するMSC治療によって生じる、損傷局所および損傷上位脊髄および脳における神経可塑性の賦活化は、損傷局所の白質および灰白質の神経損傷、軸索の損傷または変性を保護すること、血液脊髄関門を安定化することが寄与すると考えられた。さらに、MSC治療後に大脳皮質運動野の網羅的遺伝子解析を行った結果、複数の遺伝子の発現量に変化があり、神経再生・神経可塑性の賦活化に関与する可能性があることが判明した。従って、脊髄損傷に対するMSC治療によって、損傷局所および損傷上位脊髄および脳に惹起される神経可塑性の亢進が、運動機能の改善に関与している可能性を明らかにした。

血液脊髄関門の破綻に注目した新規ALS動物モデルの開発と骨髄幹細胞による治療

基盤研究(C)

研究期間:

2018年04月

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2021年03月

 

小野寺 理恵, 佐々木 祐典, 岡 真一, 佐々木 優子, 本望 修

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筋萎縮性側索硬化症 (ALS)動物モデルに対して、骨髄間葉系幹細胞（MSC）を経静脈的に投与した結果、有意に病状の進行を抑制した（運動機能低下および脊髄運動神経細胞の減少、血液脳関門の破綻が抑制）。さらにMSC治療群は神経栄養因子NeurturinのmRNAの発現量が高くMSCの治療効果の1つであることが示唆された。これらの結果からMSCは血液脳関門の破綻を抑制し、神経栄養因子（Neurturin）を分泌することで運動神経保護作用が示唆され、ALS治療の1つとして有用であると推察された。さらに、MSCを複数回投与した結果、単回投与に比べて、有意に病状の進行は抑制され、寿命延伸効果が得られた。

術後虚血性脊髄障害に対する間葉系幹細胞を用いた治療法の開発

基盤研究(C)

研究期間:

2018年04月

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2021年03月

 

安田 尚美, 佐々木 祐典, 川原田 修義, 本望 修

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虚血性脊髄障害モデルラットに対する骨髄間葉系幹細胞（Mesenchymal Stem Cells : MSCs）の経静脈的投与が治療効果を検討した。モデルラットに運動障害発症１日後にMSCを投与し２８日間観察して非投与群と運動機能を比較した。結果、MSC投与群では非投与群と比較し有意な運動機能の改善が認められた。また、MRIを用いた経時的観察においても脊髄体積の保持を認めた。組織学的検討においては、MSC投与群において、脊髄の断面積の保持、神経細胞数の保持、神経線維数の保持、微小血管系の保持を認めた。これらにより、治療メカニズムとして神経保護と血液脊髄関門の安定化が示唆された。

間質性膀胱炎に対する骨髄幹細胞移植による革新的治療法の開発

基盤研究(C)

研究期間:

2018年04月

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2021年03月

 

田端 秀敏, 舛森 直哉, 佐々木 祐典, 本望 修

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ハンナ型間質性膀胱炎を想定したToll-like receptor7（TLR7)刺激ラットモデルを作製した。TLR7刺激薬（Loxisolivin；LX）を膀胱内注入した24時間後に骨髄幹細胞もしくは細胞なしの培養液をラットに経静脈的に投与した。投与3日後に間質性膀胱炎症状（疼痛行動、排尿行動）と病理組織学的に炎症所見を評価した。骨髄幹細胞投与群は培養液投与群と比較して、疼痛、排尿回数、1回排尿量の悪化が抑制された。また、浮腫、出血、好中球浸潤などの炎症所見の悪化も有意に抑制された。

脊髄損傷に対する骨髄間葉系幹細胞移植による、上位中枢神経における可塑性亢進の解析

基盤研究(C)

研究期間:

2018年04月

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2021年03月

 

岡 真一, 本望 修, 佐々木 祐典, 佐々木 優子, 中崎 公仁, 鈴木 淳平, 長濱 宏史

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脊髄損傷等の神経損傷に対して自家骨髄間葉系幹細胞(MSC)を経静脈的投与することによって、神経機能が回復することが明らかとなっている。投与した細胞の作用は、損傷部位の局所的修復のみならず、より上位の脊髄、脳を賦活するメカニズムが考えられている。今回我々は、ヒトおよび動物実験モデルにおける脊髄損傷に対するMSC投与後のMRI解析、動物モデルについては組織学的解析を同時に実施し、神経回路の再編成が生じていることを明らかとした。

脊損に対する骨髄幹細胞移植における介在ニューロンにより再構築される神経回路の解析

基盤研究(C)

研究期間:

2018年04月

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2021年03月

 

廣田 亮介, 佐々木 祐典, 押切 勉, 森田 智慶, 寺島 嘉紀, 中崎 公仁, 岡 真一, 佐々木 優子, 山下 敏彦, 本望 修

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これまでに脊髄損傷後に生じる脳内の神経回路の再構築が、MRI diffusion tensor imagingなどを用いて報告されているが、詳細な神経解剖学的手法を用いた報告は少ない。本研究の目的は順行性神経トレーサーとして知られるアデノ随伴ウイルス（AAV）を用いて、脊髄損傷後の脳内における神経回路の再構築を詳細に解析した。 CAGプロモーターを搭載したAAV-8は、脳内における形質導入効率、順行性追跡能、細胞選択的標識能が高いことが判明した。さらに、同ベクターを用いて、脊髄損傷後の脳を解析した結果、神経回路の再構築が生じていることが示唆された。

悪性神経膠腫に対する浸潤能の分子メカニズムの解明と制御による革新的治療法の開発

基盤研究(C)

研究期間:

2017年04月

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2020年03月

 

鰐渕 昌彦, 佐々木 祐典, 三上 毅, 三國 信啓, 小松 克也, 中崎 公仁, 本望 修

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原発性脳腫瘍のうち、最多を占めるグリオーマは、集学的治療を施行しても完治困難である。その理由として浸潤能の強さが挙げられるが、関与する因子や機序は不明である。本研究で、予後と関与する因子として、ACTC1（actin alpha cardiac muscle 1）、 SERPINEA1、IL13 receptor alpha 2を同定し、さらにACTC1は悪性グリオーマの浸潤能に深く関わる因子であることを見出した。また、ACTC1の発現を抑制することで、グリオーマ細胞の遊走能が有意に抑制されることが判明した。浸潤に関与する因子を治療の標的とすることで、グリオーマの予後改善が期待できる。

慢性期脊損に対する骨髄幹細胞移植によるplasticity賦活化による機能回復

基盤研究(C)

研究期間:

2017年04月

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2020年03月

 

森田 智慶, 佐々木 祐典, 押切 勉, 廣田 亮介, 中崎 公仁, 鰐渕 昌彦, 本望 修, 山下 敏彦

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われわれはこれまでに、急性期から慢性期にかけての脊髄損傷(SCI)動物モデルに対して骨髄間葉系幹細胞(MSC)を経静脈的に移植し、運動機能の回復が得られることを報告してきた。 MSC移植を行った脊髄損傷ラットモデルに対して、大脳皮質運動野から抽出したmRNAの網羅的遺伝子解析を行ったところ、複数の遺伝子の発現量に変化が見られ、これらの遺伝子の多くは神経再生、plasticityの賦活化に関与する可能性がある遺伝子であることを発見した。特にコントロール群と比べてMSC治療群で発現が高かった7個のcoding遺伝子の発現量は、運動機能(BBBスコア)と高い相関があることが判明した。

脳梗塞に対する骨髄幹細胞移植による脳のplasticity亢進による神経機能回復

基盤研究(C)

研究期間:

2017年04月

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2020年03月

 

鈴木 淳平, 佐々木 祐典, 長濱 宏史, 中崎 公仁, 本望 修

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実験的脳梗塞に対してMSCを経静脈的に移植した結果，運動機能の改善が得られることが判明した．神経機能の回復をもたらすMSCの治療メカニズムとして，投与したMSCによって脳の機能的代償変化が賦活化されるとともに，特に左右大脳半球を結ぶ神経線維を損傷から保護することで，自然回復で得られる以上の運動機能の改善に貢献していることを報告した（Nagahama et al., Brain Res, 2018）．この結果から我々は，MSC治療によって，脳内には明らかな神経回路の再構築が惹起される可能性を見出した．

筋萎縮性側索硬化症に対する骨髄間葉系幹細胞移植による新たな治療法の開発

基盤研究(C)

研究期間:

2017年04月

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2020年03月

 

小野寺 理恵, 佐々木 祐典, 本望 修

脳梗塞に対する骨髄幹細胞とリハビリ併用による脳と脊髄のplasticityの解析

基盤研究(C)

研究期間:

2017年04月

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2020年03月

 

佐々木 雄一, 佐々木 祐典, 本望 修, 山下 達郎

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実験的脳梗塞に対するリハビリテーション（リハビリ）と骨髄間葉系幹細胞(mesenchymal stem cells: MSC)の経静脈内投与(MSC治療)の併用療法による治療メカニズムを検討した。MSC治療により、神経可塑性の亢進や血漿内BDNFの増加を認めた。これらの結果は、MSC治療の効果を判断する新たな指標になりうる可能性が考えられた。さらに、リハビリ併用群においても、同様の傾向が得られたことから、今後は、リハビリ併用による神経可塑性の検討を継続し、治療効果を最大限に引き出すリハビリプロトコルの確立に向けた研究を進める必要があると考えられた。